Автореферат (1152196), страница 10
Текст из файла (страница 10)
В 180-200 раз слаще сахара по сравнениюс 10% раствором сахарозы. РебD проявляет максимальное собственное поглощение при 1730 см1. Точка плавления - 248-249°C, растворимость в воде около 0,2%, которая увеличивается принагревании. Растворим в разбавленных растворах метанола, этанола, н-пропанола иизопропанола. Не растворим в ацетоне, хлороформе, бензоле и эфирах. РебD стабилен приразличных pH и нагревании (Abelyan, Abelyan, 2012).
Он может служить в качестве натуральноговысокоинтенсивного подсластителя в продуктах питания, напитках, фармацевтическихкомпозициях, косметике, жевательных резинках, зубных пастах и т.д.643.2.2. Трансгликозилирование РебD с помощью ЦГТазыТрансгликозилирование РебD с помощью ЦГТазы проводили с использованием крахмала,g-ЦД или их смеси в качестве донора глюкозных единиц (Abelyan, 2009; Abelyan, Abelyan, 2012;Чхан, Мойсеяк, 2019а).10 г 96%-ной чистоты РебD и 12 г g-ЦД (мол/мол к РебD) нагрели в 100 мл воды (рН 6,57,0) до полного растворения. Раствор охлаждали, суспендировали крахмал в соотношении 1:1(в/в) к g-ЦД и добавляли 2 ед/г ЦГТазу Geobacillus stearothermophilus и разжижениеосуществляли при постепенном увеличении температуры до 80-85°С и выдерживали 20 мин припостоянном интенсивном перемешивании.
Смесь охлаждали до 65оС и добавляли вторуюпорцию ЦГТазы в количестве 10 ед/г крахмала и реакцию трансгликозилирования осуществлялипри 65оС в течение 48ч при постоянном перемешивании. По истечении этого времениреакционную смесь подвергали термообработке при 100оС в течение 10 мин для инактивациифермента, реакционную смесь обрабатывали активированным углем, фильтровали, очищали накрупнопористой адсорбционной смоле Diaion HP-20, концентрировали и высушивали (рисунок27).Выделение и очистку индивидуальных производных осуществляли на 10-ти колонках сосмолой Diaion HP-20 (100мл смолы), соединенных между собой параллельно.
Процессосуществляли аналогично вышеописанному для РебА.Через колонки пропускали 20%-ный раствор гликозилированного РебD в количестве 6070% от общей адсорбционной емкости носителя.Колонки по отдельности последовательно промывали тремя объемами воды и 10%-ногоэтанола с целью удаления сопутствующих веществ, и элюцию гликозидов осуществляли пятьюобъемами 50%-ного этанола.Аналогично РебА, в первых колонках преобладающим является непрореагировавшийРебD, количество которого постепенно снижается от колонки к колонке. В то же время,распределение производных имеет обратную зависимость.
Причем, сродство производных кносителю уменьшается с молекулярной массой. В колонках 6-10 гликозидов не обнаружили(таблица 10 и рисунок 27).65Таблица 10 - Соотношение РебD и производных в различных колонкахГликозидРебDРебD-G1РебD-G2РебD-G3РебD-G4РебD-G5РебD-G6РебD-G7Количество гликозидов в разных колонках, %Исходный#-1#-2#-3#-422,636,131,210,21,532,128,926,525,310,224,921,821,629,320,012,49,817,022,429,64,23,43,74,115,42,18,711,71,37,01,14,6#-51,08,117,814,114,725,111,97,3Исходная реакционная смесьКолонка-1Колонка -2Рисунок 27 - Продолжение66Колонка-3Колонка -4Колонка -5Рисунок 27 - ВЭЖХ-граммы накопления РебD и его производных в различных колонках сDiaion HP-20Фракции из колонок 4 и 5 с низким содержанием непрореагировавшего РебD соединяли,высушивали досуха и обрабатывали b-амилазой аналогично вышеописанному в случае с РебА.Получали продукт с содержанием 2,3% непрореагировавшего РебD, 18,6% РебD-G1, 35,9%РебD-G2, 31,0% РебD-G3 и 12,2% РебD-G4.
Через 7 часов гидролиза продукт содержал 20,0%непрореагировавшего РебD, 35,2% РебD-G1, 32,2% РебD-G2, и 12,6% РебD-G3 (рисунок 28).67Исходная смесьПродукт после обработки амилазойРисунок 28 - ВЭЖХ-грамма объединенных фракций с низким содержанием интактногоРебD после обработки b-амилазойДля обогащения его моно- и ди-гликозилированными производными, смесь обрабатывалиглюкоамилазой, как в случае с РебА и повторно очищали на десяти колонках с Diaion HP-20.Суммарные элюаты из колонок 1 и 2, и 4-5 после дополнительного гидролиза глюкоамилазой иочистки на крупнопористом адсорбенте содержали более 70% РебD-G1 и РебD-G2,соответственно.Трансгликозилирование РебD успешно осуществляли также с использованием только g-ЦДв качестве донора глюкозных остатков в различных весовых соотношениях: 1:1; 1:2 и 1:3 (в/в).Например, 35 г g-ЦД растворяли в 300 мл воды и добавляли 35 г 96%-ого РебD.
Смесь нагревалидо полного растворения, охлаждали до комнатной температуры и добавляли 10 ед/г g-ЦД ЦГТазыGeobacillus stearothermophilus. Реакцию трансгликозилирования осуществляли при 65оC втечении 48 ч при постоянном перемешивании. Реакцию останавливали кипячением и обработкойактивированным углём. Результаты анализов суммированы в таблице 11 и рисунке 29. Показано,что с повышением концентрации g-ЦД количества высокомолекулярных производныхувеличивается, т.е.
происходит более быстрое и глубокое трансгликозилирование. Реакционные68смеси обрабатывали аналогично как в случае с использованием крахмала или смеси крахмала сg-ЦД.Таблица 11 - Соотношение гликозидов после трансгликозилирования РебD в присутствииразличных количеств g-ЦДГликозидыРебDРебD-G1РебD-G2РебD-G3РебD-G4РебD-G5Количество гликозидов, %РебD/g-ЦД=1:1 (в/в)РебD/g-ЦД=1:2 (в/в)РебD/g-ЦД=1:3 (в/в)36,828,423,831,227,624,116,715,816,49,511,812,75,812,717,23,75,8РебD/g-ЦД=1:1 (в/в)РебD/g-ЦД=1:2 (в/в)69РебD/g-ЦД=1:2 (в/в)Рисунок 29 - ВЭЖХ-грамма трансгликозилированного РебD ЦГТазой в присутствии g-ЦД3.2.3.
Трансгликозилирование РебМ с помощью ЦГТазыАналогичным с РебD способом реализовывали трансгликозилирование РебМ с помощьюЦГТазы Geobacillus stearothermophilus и с использованием g-ЦД. Через 48 ч реакции реакционнаясмесь содержала РебМ, РебМ-G1, РебМ-G2 и РебМ-G3 в соотношении 3,8/2,9/1,6/1,0 (рисунок30) (Abelyan, 2009; Абелян, 2001; Чхан, Мойсеяк, 2019)РебМТрансгликозилированный РебМРисунок 30 - ВЭЖХ-грамма интактного и трансгликозилированного РебМ ЦГТазой вприсутствии g-ЦД70ГЛАВА 4ТРАНСФРУКТОЗИЛИРОВАНИЕ РЕБАb-ФРУКТОФУРАНОЗИДАЗОЙСцельюулучшениявкусовыххарактеристик,РебАподвергалитакжеb-2,6-трансгликозилированию с помощью b-фруктофуранозидазы из Arthrobactеr sp. К-1 и сахарозы вкачестве источника фруктозных единиц (Chkhan, 2019)Для b-фруктофуранозидазы реакция гликозилирования схематично можно представитьследующим образом:1.
Гидролиз2. Самотрансферазная реакция3. Трансферазная реакция к акцепторугде F является остатком фруктозы, а А - акцептором.b-2,6-Трансфруктозилирование приводило к существенному улучшению вкусовых качествстевиозида и рубузозида. b-2,6-трансфруктозилирование протекало в положении 19-Oглюкозной единицы. Для этого фермент (50 единиц) инкубировали с сахарозой (2,0M) вприсутствии стевиозида или рубузозида (0,05M) в 50мM фосфатного буфера (pH 6,5; 31 мл) при40oC в течение 16 ч. Реакцию останавливали нагреванием при 100oC 10 мин, центрифугировалии реакционную смесь очищали на Diaion HP-20 и силикагеле. Полученные производные былиидентифицированы как b-D-фруктофуранозил-2,6-b-D-глюкопиранозил эстер стевиолбиозида иb-D-фруктофуранозил-2,6-b-D-глюкопиранозил эстер стевиолмонозида для стевиозида ирубузозида, соответственно (рисунок 31).
При этом, сладость компонентов не увеличилась,однако вкусовые характеристики обоих производных существенно превосходили таковыеисходных гликозидов. Особенно это было ярко выражено для фруктозилированного стевиозида,качество вкуса, горечь и послевкусие которого были сопоставимы с аспартамом (таблица 12)(Ishikawa et al., 1991).71Рисунок 31- Фруктозилированные гликозиды cтевии (Ishikawa et al., 1990)Таблица 12 - Органолептическая оценка фруктозилированных производных (Ishikawa etal., 1990)КомпонентГоречьПослевкусиеОбщее качествовкусаФруктозил4,64,22,9стевиозидФруктозил2,62,71,5рубузозидСтевиозид3,33,51,5РебA3,73,51,9Аспартам4,74,33,0Оценка была проведена в образцах растворов с концентрациями,соответствующими по сладости 5% раствору сахарозы.
5, наиболеелучший; 4, значительно лучше; 3, лучше; 2, немного лучше; 1, хуже.Реакция трансфруктозилирования стевиозида с помощью β-фруктофуранозидазы изArthrobacter sр. К-1 (200-400 единиц) в присутствии сахарозы в молярном соотношении 0,5-1,0 20-40 при 40˚С в течение 24 ч следовала механизму Пинг-Понг (Ping-Pong) Bi-Bi (рисунок 32)(Suzuki et al., 2002).72(a)SucGluE(b)E-SucSucE(c)SteE-FruGluE-SucFSteFSteE-FSteH2OE-FruSteEFruE-Fru+H2OH2OEFruEE-FSteE-Fru E-Fru+H2O EРисунок 32 - Схематическая диаграмма механизма Пинг-Понг Bi-Bi для каждой реакции. (а)Синтез фруктозил-стевиозида; (б) Гидролиз сахарозы; (с) Гидролиз фруктозил-стевиозида(Suzuki et al., 2002)Свободный фермент (Е) вступает в реакцию с сахарозой (Suc) с образованием первогокомплекса (Е-Suc). Затем из комплекса Е-Suc высвобождается глюкоза (Glu), с образованиемвторого комплекса E-Fru.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
