Автореферат (1152196), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Экстракт высушивают нараспылительной сушке (Zhang et al., 2000).Процесс очистки может быть осуществлен непрерывно с помощью хроматографии напсевдоподвижном слое (SMBC). Листья экстрагируются 25 объемами воды под ультразвуком(50-90 кГц) в течение приблизительно 1 часа, затем смесь отфильтровывают. Фильтратобрабатывают Ca(SO4)2 (0,6-1,2% от общего раствора) и СаО (0,6-1,2% от общего раствора), рНдоводят до 7,0 с помощью HCl и хранят при температуре 50-60oC в течении 0,5-3,0 часов,образовавшийся осадок отделяют фильтрованием. Фильтрат концентрируют до 8-30%содержания гликозидов, затем применяется система SMBC, макропористые смолы АВ-8, ADS-8,D-06, ADS-7 или ADS-17.
Для адсорбции скорость потока 5-12 BV/h, где BV – объём колонкизаполняемый смолой, h - час; промывка выполняется с помощью деионизированной воды срасходом 8-30 BV/h. Регенерация осуществляется 2-4%-ным раствором гидроксида натрия принизкой скорости 4-108 BV/h. Десорбция осуществляется 50-70%-ным раствором этанола (1-4объемами от количества смолы). Раствор, содержащий 60-90% общих стевиолгликозидов,выпаривают до 20-45% и сушат распылением (Patent Chinese Appl.
CN101717418, 2010). Припомощи соответствующей адсорбционной смолы процесс может быть более эффективным посравнению с обычными периодическими системами, особенно, если процесс проводить всистемах на основе воды.Очистка индивидуальных гликозидовЕсть несколько подходов выделения и очистки отдельных стевиолгликозидов, такие какхроматографическое обогащение, кристаллизация из органических растворителей, гельфильтрация, жидкостная хроматография и непрерывное хроматографическое разделение наводной основе.В настоящее время большинство промышленных технологий для производства гликозидовстевии высокой чистоты основываются на их избирательных способностях осаждения иликристаллизации при использовании различных растворителей, в особенности этанола и метанолаили их комбинации.Например, этанол является основным органическим растворителем, применяемым дляпроизводства высокочистого РебА. В зависимости от качества исходного экстракта, а такжесодержания РебА и минорных гликозидов, могут быть использованы различные схемы дляпромышленного производства.
Однако, все они предполагают осаждение-обогащение РебА на27первой стадии, с дальнейшей перекристаллизацией из водного этанола (Patent US Appl.2007/0292582, 2007).Очистку стевиозида осуществляют обработкой стевиозид-содержащего материалабезводным метанолом или водным этанолом (Abelyan, Abelyan, 2012; Patent Japan 55-092400,1980; Patent US 4,599,403, 1986; Patent US 4,171,430, 1979; Patent US 3,723,410, 1973; Patent USAppl. 2008/0292764, 2008; Patent Japan 55-162953, 1980; Патент РФ 2111969, 1998).Для очистки РебС используют метанол, этанол и их смесь, а также изопропанол (PatentWO2011/037959, 2011) и ацетон (Patent WO2012/094752, 2012).
Высокочистый РебС получентакже перекристаллизацией из 50% метанола и 55-60% этилацетата (Patent Chinese Appl.CN103804440, 2014).Рубузозид может быть использован в качестве подсластителя, а также усилителя сладостии вкуса. Высокоочищенный рубузозид получают либо из экстракта стевии или листьев Rubussuavissimus (китайская ежевика), или же ферментативным гидролизом стевиозида.Для очистки рубузозида из листьев Rubus suavissimus, их высушивают, экстрагируют,обессоливают, частично очищают на макропорыстых хроматографических носителях ивысушивают. Экстракт, содержащий 40-70% рубузозида растворяют в трех объемах 98%метанола, выдерживают при 60-65оС в течение 10-30 мин и медленно охлаждают до 10оС икристаллизацию осуществляют в течение 24 часов.
Кристаллы отделяют, перекристаллизуют из4-х объемов 85% водного раствора метанола, промывают 92%-ным метанолом при 30оС,отделяют и сушат. Чистота рубузозида составляет более 98% (Darise et al., 1984; Patent US Appl.US2013/0040033, 2013; Patent US Appl. 2011/0160311, 2011).Рубузозид получен также ферментативным гидролизом стевиозида.
Стевиозид (чистотойоколо 98%) растворяли в 5-ти объемах воды при 80оС, охлаждали и обрабатывалигесперидиназой (Aspergillus niger, Sigma-Aldrich) или пектиназой (Viscozyme L, Novozymes) при50оС и 37оС, соответственно в течение 24 часов. Реакционную смесь обрабатывалиактивированным углем, фильтровали, концентрировали и сушили. Содержание рубузозидадостигает до 60-78% в случае с гесперидиназой, при пектиназе степень трансформациистевиозида достигает до 99% (рисунок 5а). Дальнейшая очистка рубузозида осуществлена как вслучае с экстрактом (рисунок 5б) (Patent US Appl. US2015/0118379, 2015).28(А)(Б)Рисунок 5 - ВЭЖХ-грамма рубузозида до и после очисткиВ листьях стевии РебВ содержится в незначительных количествах (Kennelly, 2002b),поэтому его получают путем щелочной изомеризации РебА с помощью 1М раствора КОН(можно использовать также другие щелочи и их спиртовые растворы) при 80оС в течение 7-24часов.
Реакционную смесь нейтрализуют до рН 4,0-5,0, и выпавший осадок РебВ промываютводой. Чистота продукта более 99% (Kohda et al., 1976b; Chaturvedula, Prakash, 2011d; Abelyan,Abelyan, 2012).Путем добавления РебВ или увеличения его концентрации в экстракте стевии иликомпозициях, содержащих сладкие гликозиды, можно уменьшить неприятные вкусовыехарактеристики, такие как горечь, солодковое послевкусие, либо получить сладость наибольшесхожую с природными калорийными подсластителями (Patent US Appl. US2012/0269954, 2012;Patent WO/2011/090709, 2011; Patent US Appl. 0116835, 2007).Очистка минорных гликозидов РебD и РебМ также была осуществлена в лабораторииметодами обогащения экстракта во время его очистки на крупнопористых носителях иселективного осаждения/кристаллизации с помощью различных органических растворителей.Экстракт пропускали через серию колонок с носителем и, так как сродство РебD и РебМ кносителю меньше, чем у стевиозида и РебА, то они концентрируются в последних колонках.
Их29отдельно элюировали водным раствором этанола, обессоливали, обесцвечивали и высушивали.Очистку индивидуальных гликозидов осуществляли этиловым и метиловым спиртами, а такжеводой. Детальная очистка РебD приведена в экспериментальной части диссертации.Получение и очистка стевиoлбиозида осуществлены аналогично процессу РебВ, используястевиозид в качестве исходного материала. Раствор стевиозида в 10% КОH (1:45 вес/объем)кипятили в течении 2-х часов, реакционную смесь подкисляли до pH 3,0 10%-ной H2SO4,фильтровали и охлаждали, чтобы осадить стевиолбиозид в виде кристаллов.
Стевиолбиозидперекристаллизовали из метанола, промывали холодной водой и сушили (Chaturvedula, Prakash,2011c; Patent US 4,381,402, 1983; Patent US 4,454,290, 1984; Wood et al.,1955).1.3. Ферментативная модификация гликозидов стевииКак уже было отмечено, гликозиды стевии обладают остаточной горечью и послевкусием,которыевлияютнаегокачественныехарактеристики.Ихможноснятьреакциеймежмолекулярного трансгликозилирования под действием различных ферментов, в течениекоторой происходит присоединение новых углеводов в положениях C-13 и C-19. Количествоуглеводных единиц в указанных позициях определяет качество и степень сладости компонента.В качестве трансгликозилирующего фермента используют пуллуланазу, изомальтазу(Lobov et al., 1991), b-галактозидазу (Kitahata et al., 1989a) и декстран сахаразу (Yamamoto et al.,1994), а в качестве доноров - пуллулан, мальтозу, лактозу и частично гидролизованный крахмал,соответственно.Обработка пуллуланазой приводит к получению 13-О-[b-мальтотриозил-(1,2)- b-Dглюкозил]-19-O-b-D-глюкозил-стевиола;13-О-[b-мальтозил-(1,2)-b-D-глюкозил]-19-O-b-D-глюкозил-стевиола и 13-О-[b-сефорозил-19-O-b-мальтотриозил-стевиола.
В случае с мальтазойтакжеполученытритрансгликозилированныхпродукта:13-О-[b-софорозил-19-O-b-изомальтозил-стевиол; 13-О-[b-изомальтозил-(1,2)- b-D-глюкозил]-19-O-b-D-глюкозил-стевиоли 13-О-[b-нигерозил-(1,2)- b-D-глюкозил]-19-O-b-D-глюкозил-стевиол. Некоторые из нихобладают прекрасными вкусовыми качествами.Три гликозилированные производные получены при обработке стевиозида b-амилазой вприсутствии мальтозы в качестве донора, а именно: (а) b-О-a-глюкозилированное производноепри C-19; (б) b-О-a-глюкозилированное производное при C-13 и (в) 3-O-a-глюкозилированноепроизводное при C-13.
Сладость производных (а) и (б) ниже, чем у стевиозида, однако дляпроизводного (а) наблюдалось существенное улучшение вкусовых качеств. Это является первымпримером улучшения вкуса добавлением глюкозы в позиции C-19-O-глюкозильного остатка. В30принципе, в пищевой промышленности вкусовые качества более важны, чем характерподсластителя и его количество. Компонент (в) обладает горьким привкусом, если дажедополнительно глюкозилировать в позиции С-13 софорозильного остатка (Lobov et al., 1991;DuBois, 1985).
Таким образом, тип боковых глюкозных единиц имеет существенное влияние нахарактер сладкого вкуса гликозидов.Обработка декстран сахаразой Acetobacter capsulatus ATCC 11894 смеси стевиозида игидролизата крахмала изоамилазой приводит к образованию моно- и диглюкозил-производныхстевиозида в качестве основных трансглюкозилированных продуктов. Моноглюкозилпроизводные представляют собой 13-О-[(6-a-глюкозил(2-b-глюкозил)-b-глюкозил]-19-О-bглюкозил-стевиол и 13-О-(6-a-глюкозил-2-b-глюкозил-b-глюкозил-19-О-b-глюкозил-стевиол(SG1 и SG2), а ди-производное - 13-О-(6-a-глюкозил(6-a-глюкозил-2-b-глюкозил)-19-О-bглюкозил-стевиол (2m) (рисунок 6) (Yamamoto et al., 1994).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
