Автореферат (1152196), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Сравнительная сладость всехполученных соединений была существенно ниже таковой для исходного стевиозида.Рисунок 6 - Транс-a-глюкозилирование стевиозида с помощью декстран сахаразы (Ohtani,Yamasaki, 2002)Обработка стевиозида с помощью трансгликозилирующего фермента Streptoтyces sp. W191 в присутствии курдлана (линейный b-1,3-глюкан) приводит к образованию трех транс b-1,3глюкозилированных продуктов: (а) SbG1а: 13-O-b-софорозил-19-O-b-ламинарибиозил-стевиол;31(б) SbG1b: b-О-[b-глюкозил-(1,3)- b-глюкозил-(1,2)- b-глюкозил]-19-O-b-глюкозил-стевиол и (в)SbG2: 13-O-b-софорозил-19-O-b-ламинаритриозил-стевиол. Улучшение вкусовых качествотмечается для SbG1а и SbG2, а также смеси продуктов, хотя интенсивность их сладости быланиже, чем у стевиозида (рисунок 7).Рисунок 7 - Транс-a-глюкозилирование стевиозида b-1,3-глюканазой в присутствиикурдлана (Ohtani, Yamasaki, 2002)Обработка стевиозида ферментом Streptoтyces sp.
DIC-108 в присутствии b-1,3-глюканаприводит к образованию РебА.При применении β-фруктофуранозидазы из Arthrobacter sp. и сахарозы в качестве донора,происходиттранс-β-2,6-фруктофуранозилирование19-О-глюкозильногоостатка.Образовавшиеся остатки обладали отличными вкусовыми качествами, однако отличалисьнестабильностью и легко подвергались гидролизу (Ishikawa et al., 1990).Трансгликозилирование гликозидов стевии осуществлено также b-галактозидазой изразличных источников, используя лактозу в качестве донора гликозильных единиц. Всеферменты образовывали четыре производные: 13-O-b-D-глюкозил-19-О-[b-D-галактозил-1,4-bD-глюкозил]-стевиол(RGal-1);13-O-b-D-галактозил-1,4-b-D-глюкозил-19-О-b-D-глюкозил-стевиол (RGal-2); 13-O-b-D-глюкозил-19-О-[b-D-галактозил-1,6-b-D-глюкозил]-стевиол (RGal3) и 13-O-[b-D-галактозил-1,6-b-D-глюкозил]-19-О-b-D-глюкозил-стевиол (RGal-4).
Однако, они32устраняют горечь рубузозида только частично из-за низкого выхода производных с требуемымикачественными характеристиками (рисунок 8) (Kitahata et al., 1989b).Рисунок 8 - Продукты трансгликозилирования рубузозида с помощьюb-галактозидазы (Kitahata et al., 1989a).Наилучшие результаты получены при трансгликозилировании с помощью ЦГТазмикробного происхождения, таких как Bacillus macerans, Geobacillus stearothermophilus, Bacillusmegaterium и других с использованием крахмала (донор) (Fukunaga et al., 1989; Patent US4,219,571,1980).Врезультатеобразуютсяα-1,4-глюкозил-производные,причемтрансглюкозилируются как 13-О-, так и 19-О-глюкозильные остатки в молекулах стевиозида ирубузозида.
Практически все полученные производные обладают улучшенными вкусовымикачествами (Abelyan, 2005; Kasai et al., 1981; Ohtani et al., 1991).Наилучшие результаты получаются при удлинении глюкозидной цепи в позиции C-13 до 4единиц, с неизменностью позиции C-19. Любое присоединение глюкозила к положению C-19приводит к ухудшению вкусовых качеств производных. Наилучшими вкусовыми качествами каксреди компонентов экстракта, так и его производных обладают моно- и ди-глюкозилированныепроизводные, которые могут быть получены селективно и использованы в качествепревосходных заменителей сахара.Для улучшения вкусовых характеристик, продукт обрабатывают b-амилазой с цельюгидролиза высокомолекулярных производных стевиозида и очищают хроматографическимпутем. Основными компонентами полученной смеси являются моно- и диглюкозилированныеварианты стевиозида (Kasai et al., 1981; Kitahata, 2001; Patent Japan 03-83558, 1991; Patent Japan03-262458, 1991; Patent US Appl.
201110023192, 2011; GRAS assessment, 2011).33Обобщая далеко не исчерпывающий обзор литературы по сладким гликозидам Steviarebaudiana Bertoni, можно сделать следующее заключение:- Гликозиды Stevia rebaudiana Bertoni имеют не только интенсивный сладкий вкус, но иоказывают определенное оздоровительное влияние на организм.- Разработано множество методов их выделения из листьев, однако существуютопределенные трудности при их полной экстракции и тонкой очистке.- Нет систематических и сравнительных исследований по модификации гликозидовразличными ферментами и изучение взаимосвязи между структурными особенностямимодифицированных производных и вкусовыми качествами.- Разработка эффективных методов выделения и очистки некоторых минорных гликозидов,обладающих отменными вкусовыми характеристиками, становится насущной необходимостью.- Разработка эффективных методов трансгликозилирования и получение производных снаилучшими вкусовыми характеристиками поможет создавать оптимизированные смеси,соответствующие требованиям пищевой промышленности для отдельных видов продуктов, исладость которых наиболее близка к сахару.34ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬГЛАВА 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙОбьектом исследования служилa стевия (Stevia rebaudiana Bertoni).2.1. Ферменты ЦГТаза и β-фруктофуранозидазаВ качестве продуцента цикломальтодекстрин глюканотрансферазы (ЦГТазa) былиспользован Geobacillus stearothermophilus St-88 из коллекции культур микроорганизмовкомпании PureCircle Ltd. (Малайзия).В качестве продуцента β-фруктофуранозидазы использовали штамм Arthrobacter sp. (K-1)FERM BP-3192 из коллекции культур NBRC (IPOD), Япония.Выращивание штаммов в глубинных условиях осуществляли на качалках типа Certomate IS(B.
Braun Biotech. Int., Германия) и в ферментере Biostat B (B. Braun Biotech. Int., Германия) наследующих питательных средах:Культура-продуцент ЦГТазGeobacillus stearothermophilus (г/ дм3): Крахмал – 7,0; кукурузный экстракт – 5,0; NH4Cl –5,3; CaCO3 – 2,5 (рH 6,5; 56°C) (Абелян и др., 2002).Культура-продуцент β-фруктофуранозидазыArthrobacter sp. K-1 (г/ дм3): Кукурузный экстракт – 5,0; сахароза – 3,0; (NH4)2HPO4 – 0,4;MgSO4x7H2O – 0,1 (рH 7,0; 37°C) (Fujita et al., 1990).β - амилазаИспользовали ферментный препарат β – амилаза #1500S (Nagase, Япония), активность 1500ед/г.ГлюкоамилазаИспользовали ферментный препарат глюкоамилазы Glucoamylase AMG 300L, aктивность300 ед / см3, Novozyme, Дания.352.2. Определение ферментативной активности2.2.1. Определение ферментативной активности ЦГТазЦиклизирующая активность ЦГТазМетод основан на специфическом определении a-ЦД. К 1 мл 3%-ного раствора крахмала(оптимальный рН) добавляли 0,5 см3 фермента и смесь инкубировали при оптимальнойтемпературе.
Через определенные интервалы времени 3 капли реакционной смеси смешивали с1 каплей раствора 0,1N I2 в 0,1М KI и после фиксации на предметном стеклемикроскопированием определяли наличие a-ЦД. С появлением гексагональных кристалловреакцию считали законченной. За единицу активности принимали количество фермента, котороетрансформирует 1 см3 3%-ного раствора крахмала за 30 мин (Tilden, Hudson, 1942).Декстринизирующая активность ЦГТазК 10 см3 2%-ного раствора крахмала с оптимальным значением рН добавляли 4 мл растворафермента и инкубировали при оптимальной температуре.
Через определенные интервалывремени отбирали 0,5 см3 пробы и приливали раствор 0,0035М I2 в 0,26М KI в количестве 5 см3.Объем раствора доводили до 10 см3 дистиллированной водой и через 3 мин определялиоптическую плотность при 660 нм. За единицу активности принимали количество фермента,которое за 10 мин в условиях эксперимента конвертирует 50% крахмала. Эта единица примернов 25 раза больше соответствующей единицы Тильдена-Хадсона (Hale, Rawlins, 1951).Диспропорционирующая активность ЦГТазРеакционная смесь, содержащая испытуемый препарат фермента, 10 мг растворимогокрахмала, 50мМ сахарозы и 10мМ CaCl2 в 1 см3 0,1М буфера, инкубировали при 40°С в течение10 мин.
Реакцию останавливали кипячением и после центрифугирования определяли количествомальтозилфруктозы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) наколонке Zorbax-NH2 («Agilent 1100 Series», США) с использованием подвижной фазыацетонитрил-вода (70:30) и дифференциального рефрактометра в качестве детектора. За единицуактивности принимали количество фермента, образующее 1 µмоль мальтозилфруктозы за 1 мин(Akimaru et al., 1991).36Дециклизирующая активность ЦГТаз1,0 см3 реакционной смеси, содержащей фермент, 5мМ b-ЦД, 10мМ CaCl2 в 0,1М буфере(соответствующий рН) и 150 мкг глюкоамилазы, инкубировали при 40оС в течение 10 мин.
Затемопределяли количество редуцирующих сахаров. За единицу активности принимали количествофермента, гидролизующее 1 µмоль b-ЦД в минуту (Akimaru et al., 1991).Трансгликозилирующая активность ЦГТазРеакционную смесь, содержащую препарат ЦГТазы (4,0 ед.), 10 мг растворимого крахмала,50 ммоль сахарозы и 10 ммоль CaCl2 в 1 см3 0,1М буфера (рН 6,5) инкубировали при 50оC втечение 15 мин.
Реакцию останавливали кипячением (10 мин) и после центрифугирования(10000 g, 10-15 мин) определяли количество мальтозилфруктозы методом ВЭЖХ на колонкеZorbax-NH2 («Agilent 1100 Series», США) с использованием подвижной фазы ацетонитрил-вода(70:30) и дифференциального рефрактометра в качестве детектора. За единицу активностипринимали количество фермента, образующее 1 мкмоль мальтозилфруктозы за 1 мин (Akimaruet al., 1991).Для определения влияния различных ионов металлов на активность ЦГТазы ферментдиализовали против дистиллированной воды в течение 24 ч, преинкубировали в водном раствореионов в течение 30 мин при 50оС и оптимальном рН и определяли остаточную циклизирующуюактивность.Влияние температуры на активность ЦГТазы определяли в реакционной смесиследующего состава: 1 см3 2 %-ного раствора растворимого крахмала, 0,5 см3 1/15М фосфатногобуфера, рН 7,0 и 1 см3 фермента.
Смесь инкубировали при разных температурах в течение 15 мини определяли остаточную декстринизирующую активность.Термостабильность ЦГТазы определяли при инкубации 1 см3 раствора фермента в 1 см31/15М растворе фосфатного буфера, рН 7,0 в течение двух часов. Затем определяли активностьпри оптимальной температуре.Влияние рН на активность ЦГТазы изучали в реакционной смеси следующего состава:1 см3 2%-ного раствора растворимого крахмала, 0,5 см3 раствора буфера и 1 см3 фермента.Инкубировали при 50°С в течение 5 мин.Использовали следующие буферные растворы: рН 4,0-6,0 - 0,1Н ацетатный буфер; рН 6,08,0 - 1/15М фосфатный буфер; рН 8,0-10,0 - 0,2М NaOH-глициновый буфер.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
