Автореферат (1152196), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Далее вносили вторуюпорцию ЦГТазы в количестве 8,0 ед/г крахмала и реакцию осуществляли при 65оС в течение 48часов при постоянном перемешивании. По истечении этого времени реакционную смесьподвергали термообработке при 100оС в течение 10 мин для инактивации фермента,реакционную смесь обрабатывали активированным углем, фильтровали и фильтрат высушивалина распылительной сушке (рисунок 21 и 22).Для гидролиза высокомолекулярных производных 30% раствор трансгликозилированногопродукта обрабатывали 25 ед/г СВ глюкоамилазой (Novozymes, Дания) при 50оС в течение 2часов. Реакционная смесь обесцвечивали активированным углем и очищали на крупнопористыхсмолах, как это описано в случае с циклодекстрином в качестве донора глюкозных остатков.После промывки колонки водой и 10%-ным этанолом, элюцию осуществляли 50%-ным этанолом(рисунок 21 и 22).54Рисунок 21 - Трансглюкозилирование РебА ЦГТазой с использованием крахмала вкачестве донора55(а)(б)Рисунок 22 - ВЭЖХ-граммы трансглюкозилированного РебА в присутствии крахмала до (а) ипосле обработки глюкоамилазой (б).Обработанный глюкоамилазой продукт содержит немодифицированный РебА и от монодо тетра-глюкозилированные производные в соотношении, приведенные в таблице 6.56Таблица 6 - Соотношение гликозилированных производных РебА до и после обработкиглюкоамилазойКоличество производных, %РебА:крахмал (1:1)РебА:крахмал (1:1)(в/в); 48 ч(в/в); 48 ч После глюкоамилазы15,818,720,633,019,326,815,115,69,95,96,86,02,71,72,1ПродуктыРебАРебA-G1РебA-G2РебA-G3РебA-G4РебA-G5РебA-G6РебA-G7РебA-G8РебA-G9РебA-G10РебA-G11РебA-G12Малые количестваВыделение и очистка гликозилированных производных РебАВыделение и очистку индивидуальных производных осуществляли на 10-ти колонках ссмолой Diaion HP-20, соединенных между собой параллельно.
Принцип разделения основан наразнице в сродствах к носителю различных производных (Чхан, Мойсеяк, 2019в).Через колонки пропускали 20%-ный раствор модифицированного РебА в 5% этиловомспирте после двухкратной обработки глюкоамилазой и очистки на крупнопористой смоле.Количество вносимых гликозидов составляло около 60-70% от общей адсорбционной емкостиносителя. Колонки по отдельности последовательно промывали тремя объемами воды и 10%ного этанола, и элюцию гликозидов осуществляли пятью объемами 50%-ного этанола.Выявлено, что в первых колонках преобладающим является непрореагировавший РебА,количество которого постепенно снижается от колонки к колонке.
В то же время, распределениепроизводных имеет обратную зависимость. Причем, сродство производных к носителюуменьшается с молекулярной массой. В шестой колонке не обнаружился интактный РебА, а вседьмой идентифицированы только ди- и три-глюкозилированные РебА (таблица 7, рисунок 23).Таблица 7 - Соотношение гликозидов в различных секцияхГликозидРебАРебА-G1РебА-G2РебА-G3Исходный25,140,526,67,8Количество гликозидов в разных колонках, %#-1#-2#-3#-4#-5#-633,031,928,421,511,035,740,041,342,841,729,427,224,125,528,735,748,14,14,04,86,911,622,5#-70051,348,757Исходная смесьКолонка-1Колонка-3Колонка-2Колонка-4Колонка-5Колонка-6Колонка-7Рисунок 23 - ВЭЖХ-граммы накопления РебА и его производных в различных колонках сDiaion HP-20Все элюаты обработали активированным углем и высушивали под вакуумом.Из суммарного продукта, полученного из седьмой колонки, приготавливали 20% раствор иснова пропускали через систему из 10-ти колонок и процесс осуществляли аналогично58вышеописанному. Таким путем удалось получить продукты с около 80%-ным содержаниеммоно- и ди-гликозилированных производных из четвертой и седьмой колонок (таблица 8).Таблица 8 - Разделение моно и ди-гликозилированных РебА на колонке с Diaion HP-20ГликозидРебА-G1РебА-G2Количество гликозидов в разных колонках, %#-2#-3#-4#-5#-669,373,680,356,030,130,726,419,744,069,9#-165,734,3#-720,279,8Глюкозилированные производные РебА были очищены также на колонках с силикагелем.Продукт, предварительно обработанный b-амилазой, в виде 20% раствора (10 мл) пропустиличерез препаративную колонку с силикагелем объемом в 350 мл, используя смесь растворителейэтилацетат-н-пропанол-вода в соотношении 7:2:1.
Элюаты собирали фракциями по 10 мл через3,5 объема. Начальные фракции элюата содержали немодифицированный РебА в качествеосновного продукта, в то время как средние и последние - моно- и ди-гликозилированныепроизводные, соответственно (таблица 9 и рисунок 23).Таблица 9 - Распределение производных РебА на колонке с силикагелемГликозидРебАРебА-G1РебА-G2РебА-G3Количество гликозидов в разных колонках, %Исходное Фр-111-131 Фр-132-174 Фр-810-91033,89,97,248,690,192,813,272,94,427,1Фракции 1-90Исходный59Фракции 111-131Фракции 132-174Фракции 810-910Рисунок 24 - ВЭЖХ-граммы накопления РебА и его производных в различных элюатах изколонок с силикагелем3.2. Трансглюкозилирование РебD и РебМ ЦГТазой3.2.1.
Очистка РебD и РебМОчистка РебD была разработана непосредственно из коммерческого экстракта стевии, атакже из концентрата гликозидов с сравнительно высоким содержанием РебD. Причем,содержание РебD в экстракте может варьироваться в зависимости от сорта растения стевии илитехнологической схемы получения экстракта.В первом случае экстракт с содержанием 52% РебА и 1,2% РебD смешивали с тремяобъемами 85-95% этанола в соотношении 1:3 и выдерживали при 55оC в течении 20-30 мин, затемохлаждали до комнатной температуры, добавляли затравку в виде 1% РебА и выдерживали втечении 12 часов, при постоянном перемешивании.
Осадок отделяли фильтрованием ипромывали абсолютным этанолом.Выход кристаллов и степень чистоты РебА и РебD существенно зависит от их содержанияв исходном экстракте, а также концентрации и количества этанола.Осадок, представляющий собой смесь 95-96% РебА и 3,5-3,8% РебD, смешивали с тремяобъемами абсолютного метанола и, после перемешивания при комнатной температуре в течение1,5 часа, фильтровали, промывали безводным метанолом и высушивали под вакуумом при 70 оС.60Кристаллы содержали более чем 99% РебА.Остаточный раствор выпаривали с целью удаления метанола и концентрировали до 33-34%содержания сухих веществ, из которого РебD кристаллизовали при 20-22оС в течение 24 часов.Осадок, содержащий около 80-85% РебD, отделяли фильтрованием.Остаточный раствор также можно концентрировать до 60-65%-ного сиропа и оставлять втечение 2-3 суток, в течение которого происходит полное затвердевание массы.
РебD (80-85%чистоты) можно экстрагировать 2-3 объемами безводного метанола.Для дальнейшей очистки 80-85% РебD обрабатывали тремя объемами 60%-ного метанолапри 50-55оС и, затем при комнатной температуре в течение 1,5-2,0 ч. После фильтрования ипромывки с абсолютным метанолом, получили кристаллы РебD с чистотой в 98-99,2%.Схема последовательности очистки приведена на рисунок 25.61Рисунок 25 - Получение РебD из коммерческого экстракта cтевии62В случае с обогащенным с РебD (20-28%) и РебМ (10-13%) экстрактом, первичнуюобработку осуществляли 70-75%-ным раствором метанола в соотношении 1:7-1:10 (вес/объем)при 22оС в течение 48-72 ч.
Осадок 60%-ного РебD отделяли фильтрованием и промывали 15тью объемами деионизированной воды при 65-68оС в течение 1 ч. Кристаллы представляютсобой РебD с чистотой 80%, перекристаллизация которого из 50%-ного этанола (1:8-1:10,вес/объем) происходит быстро при охлаждении до 50оС и приводит к образованию РебD счистотой около 90%. Повторной перекристаллизацией 50%-ным этанолом и промывкой можнодостичь до более чем 95%-ного и более содержания РебD (рисунок 26). Очистку 80%-ной РебDможно осуществлять также промывкой горячей водой. Для этого, кристаллы суспендировали ввосьми объемах воды, подогревали до кипячения и постепенно охлаждали до 70оС припостоянном перемешивании. Повторная обработка приводит к РебD с более 97% чистотой.Сухой порошок обедненных фильтратов отличается высоким содержанием РебМ (≥50%)наряду с 38-39% РебD.
С целью выделения и очистки РебM, продукт растворяли при нагреваниив 15%-ном этаноле и перекристаллизовывали при комнатных температурах в течение 12 часов.Перекристаллизация кристаллов с содержанием 80% РебМ из воды или 15%-ного этанолаобразует РебМ с не менее чем 95% чистоты.
Для этого, 80%-ный РебМ суспендировали в восьмиобъемах воды, подогревали до кипячения и постепенно охлаждали до 70оС при постоянномперемешивании. Повторная обработка приводит к РебМ с более 95% чистотой. Во второмслучае, 80%-ный РебМ растворяли в 15%-ном этаноле при нагревании, охлаждали до 22оС иперемешивали в течение 12 ч. РебМ с более чем 95%-ной чистотой получали после фильтрованияи сушки под вакуумом (рисунок 26).63Рисунок 26 - Очистка РебD и РебМ из обогащенного экстрактаВысокоочищенный РебD представляет собой белый порошок без запаха с молекулярноймассой 1129,15 и молекулярной формулой C50H80O28.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
