Диссертация (1152193), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Для сравнения использовали коммерческий ФП ProtofermFP (Shandong Longda Bio-Products Co., Ltd., Китай), который широко применяетсяв спиртовой промышленности для улучшения показателей сбраживаемого сусла.ФП Protoferm FP представляет собой препарат кислой грибной протеазы штаммаA.
niger. Активность протеаз ФП представлена в таблице 27.Таблица 27 – Протеолитические активности ферментных препаратов,участвующих в спиртовом броженииПС, ед./гФПрН 4,7, 30℃гемоглобинProtoferm FPПЕП-ЛАП-Л800601588132100ЛАПА, ед./грН 5,0, 30℃055035ВкачествеферментаразжижающегодействияиспользовалиФПбактериальной термостабильной α-амилазы Liquoflow («Novozymes A/S», Дания),в качестве осахаривающего фермента – ФП глюкоамилазы SAN Super 360L(«Novozymes A/S», Дания).Эффективность применения ФП ПЕП-ЛАП в спиртовом броженииопределяли методом постановки бродильных проб по схеме, представленной втаблице 28.Таблица 28 – План постановки бродильных пробВариант1контрольТепловая обработказамесаОсахариваниеБрожение1,5ч при 80℃2 ч при 85–88℃1 ч при 58℃68 ч при 34–35℃+0,6 ед.
АС/г крахм.+6 ед. ГлС/г крахм.–+0,6 ед. АС/г крахм.+6 ед. ГлС/г крахм.+0,1 ед. ПС/г сырьяФП Protoferm+6 ед. ГлС/г крахм.-2+0,6 ед. АС/г крахм.3+0,6 ед. АС/г крахм.4+0,6 ед. АС/г крахм.+6 ед. ГлС/г крахм.+0,1 ед. ПС/г сырьяФП ПЕП-ЛАП+6 ед. ГлС/г крахм.5+0,1 ед. ПС/гсырья ФПProtoferm-+0,1 ед. ПС/гсырья ФП ПЕПЛАППшеничную муку (крахмалистость 57,7%) смешивали с теплой водой (50–55℃) в соотношении 1:3.
В контрольные и опытные колбы вносили раствор ФПтермостабильной -амилазой из расчета 0,6 ед. АС/г крахмала, поднималитемпературу до 80℃ и выдерживали замесы при этой температуре 1,5 часа. Далеетемпературу поднимали до 85–88℃ и выдерживали 2 часа, после этого охлаждалидо 60℃. После этого сусло осахаривали при температуре 591℃ в течение 1 часа.Для осахаривания в колбы с разваренной массой вносили глюкоамилазу израсчета 6 ед. ГлC/г крахмала; в опытные колбы (в случае вариантов 2 и 4) вносилиФП протеаз из расчета 0,1 ед.
ПС/г сырья. После осахаривания сусла иохлаждения его до 34–35℃ в опытные колбы (в случае вариантов 3 и 5) вносилиФП протеаз из расчета 0,1 ед. ПС/г. Далее в колбы вносили отмытые дрожжи (S.101cerevisiae 985Т) в количестве 10% к объему сусла. Время брожения составило 68часов. Анализ основных показателей процесса сбраживания пшеничного сусла(выделение СО2, количество дрожжевых клеток, концентрации несброженныхуглеводов) проводили ежесуточно.
Основные результаты анализов представленыв таблице 29.Полученные результаты (таблица 29) показали, что обработка пшеничногосусла ФП протеаз, как на стадии осахаривания, так и на стадии брожения,позволила существенно интенсифицировать процесс по сравнению с контролем, очем свидетельствуют основные показатели бражки (выделение СО2, количестводрожжевых клеток, концентрации несброженных углеводов и выход спирта).Низкиезначениясодержаниянесброженных углеводов в опытныхвариантах свидетельствуют о том, что применение ФП протеолитическогодействия позволило получить более глубоко выброженную бражку и увеличитьвыход спирта примерно на 1,13% об.
по сравнению с контрольным вариантом (безФП протеаз).При сравнении ФП ПЕП-ЛАП и ФП Protoferm FP можно заключить, что: 1)использование ФП ПЕП-ЛАП, как на стадии осахаривания, так и на стадииброжения сусла, позволило интенсифицировать процесс дрожжегенерации наначальных его этапах. Так, после 20 ч сбраживания количество СО2, выделенноеклетками дрожжей было выше, чем в варианте с ФП Protoferm FP на 18 и 9%,соответственно, после 44 ч сбраживания сусла это преимущество составило 11 и3%, соответственно. По окончанию процесса брожения (68 ч) показатели повыделению СО2, при использовании обоих ФП практически сравнялись; 2) выходспирта при добавлении исследуемых ФП протеаз на стадии брожения былодинаков и составил 67,2, что на 7 Дал больше, чем в контрольном варианте безиспользования протеаз.102Таблица 29 – Показатели сбраживания пшеничного сусла дрожжами S.
cerevisiae 985Т с использованием ферментныхпрепаратов Protoferm FP и ПЕП-ЛАП3ВариантКонтроль12ФПВыделение СО2, смДрожжимлн/см3/%почк.Концентрация несброженныхуглеводов, г/100 см368чСр.у44 ч Ср.у*Собщ**Скр***V, %спиртВыходспирта из 1т крахмалаВыходспиртаиз 1 тсырья20 ч44 ч68 чАС терм.
+ ГлС5,29,112,969/10% почк.5,11,81,90,19,8760,234,7АС терм. + ГлС+ Protoferm FP6,312,315,182/12%3,30,450,50,0511,0666,638,47,614,415,184/14%0,850,40,460,0611,167,238,87,413,715,176/12%1,10,480,490,0110,9566,938,68,2514,815,281/9%0,680,410,440,0311,1667,238,8На стадии осахаривания3АС терм. + ГлС+ Protoferm FPНа стадии брожения4АС терм. + ГлС+ ПЕП-ЛАПНа стадии осахаривания5АС терм. + ГлС+ ПЕП-ЛАПНа стадии брожения*Ср.у – массовая концентрация растворимых несброженных углеводов (моно-, ди-, олигосахариды);**Собщ. – массовая концентрация общих несброженных углеводов;***Скр – нерастворенный крахмал, определяется по разности Скр = 0,9(Собщ - Ср.у) [136].103Такимобразом,ФППЕП-ЛАП,полученныйнаосновеновогорекомбинантного штамма P. canescens RN3-11-7-7, может выступать в качествеболее дешевого аналога импортному ФП Protoferm FP.
Применение препаратаПЕП-ЛАПвспиртовомпроизводствепозволитсущественносократитьпродолжительность брожения за счет ускорения процесса на первоначальнойстадии, а наличие ксиланазы будет способствовать улучшению реологическихсвойств сусла, снижая его вязкость. Использование нового комплексного ФПпозволитснизитьрасходынапроизводствоиобеспечитьбезопаснуюэксплуатацию оборудования.3.5.2 Результаты испытаний in vitro ферментного препаратаПенициллопепсина в качестве кормовой добавки на зерновом сырьеДля оценки способности ферментов к увеличению питательной ценностикормов используется “кормовой” тест in vitro [138]. Данный тест основан нарегистрации образования ВС и растворимого белка в ходе гидролиза природныхкормов.Для оценки эффективности ФП ПЕП-Р (раздел 3.2.1) было выбранозерновое сырья, которое наиболее часто применяемого в кормопроизводстве длякормления моногастричных животных: ржи, пшеницы и тритикале, а такжезерновой послеспиртовой барды.
На российском рынке не существует точногоаналога комплексному ФП ПЕП-Р, поэтому в качестве сравнения выбранымоноферментные коммерческие препараты ксиланазы и кислой протеазы,которые в настоящее время широко используются в кормовой промышленности.ФП ксиланазы – Палпфор 2, продуцентом является P. canescens (ООО«Микробиопром», Москва) и ФП кислой протеазы – Acid Protease, продуцентомявляется A. niger (Beijing Challenge Biotechnology Ltd Co., Китай). Характеристикиданных ФП представлены в таблице 30.Гидролиз сырья проводили в пластиковых микропробирках объемом 2 см3при 40℃ при постоянном перемешивании. Концентрация сырья составляла 50104мг/см3 по сухой массе, ФП вносили в дозировке 6 мг ФП/г сырья. Через 3 чинкубирования полученные гидролизаты центрифугировали при 10750 g втечение 5 мин.
В супернатантах определяли содержание растворимого белка иВС.Таблица 30 – Характеристика ферментных препаратов для гидролиза зерновыхсубстратовПСФПБелокрН 4,7, 30℃гемоглобинКсАБГЛрН 5,0, 50℃рН 5,0, 50℃ПЕП-РПалпфор 2Acid Protease15612133151681365080< 0,1670601220901250120< 0,1975241< 0,1Вэкспериментахиспользовалисырьёсвысокимсодержаниемарабиноксилана – пшеницу, рожь, тритикале, являющиеся основой рационов длямоногастричныхсельскохозяйственныхпослеспиртовуюбарду.Эффективностьживотныхисовместногоптицы,действияатакжеосновныхкомпонентов комплексного ФП ПЕП-Р на полимеры зерновых субстратовоценивали в сравнении с коммерческими препаратами ксиланазы – Палпфор 2 икислой протеазы – Acid Protease, используемыми в кормопроизводстве.Полученные результаты (рисунок 28), свидетельствуют о существенномувеличении выхода растворимого белка и ВС после гидролиза субстратов всемиисследуемыми ФП.
Максимальную эффективность при гидролизе ржи, тритикалеи пшеницы проявил ФП ПЕП-Р, очевидно, за счет наличия у него как протеазной,так и гемицеллюлазной видов активностей. По сравнению с контролем (безвоздействия ферментов) применение ПЕП-Р позволило увеличить выходрастворимого белка на 29% (рожь, тритикале) и на 108% (пшеница), выход ВСувеличился на 111% и 125% на пшенице и тритикале, соответственно, и на 160% –на ржи.
Менее эффективными были коммерческие ФП: по сравнению с контролемприменение ксиланазного ФП Палпфор-2 приводило к увеличению выходаводорастворимого белка только на 10% (рожь, тритикале, пшеница); выход ВСувеличивался на 78 и 63% на пшенице и тритикале, соответственно, и на 110% –105на ржи. Протеазный ФП Acid Protease был более эффективен, чем Палпфор-2, новсе же проигрывал комплексному ФП ПЕП-Р: применение ФП Acid Proteaseприводило к увеличению выхода водорастворимого белка примерно на 16%(рожь, тритикале) и на 92% на пшенице; выход ВС увеличивался на 89% и 38% напшенице и тритикале, соответственно, и на 120% – на ржи.Содержание Белка, %250200150100500К123аРожьТритикалеПшеницаСухая бардаСодержание ВС, %350300250200150100500К123бРисунок 28 – Выход водорастворимого белка (а) и восстанавливающих сахаров(б) при обработке различных видов зерна ферментными препаратами:ПЕП-Р – 1; Палпфор-2 – 2; Acid Protease – 3.К – контроль, без ФПТаким образом, при использовании пшеницы (сырья с относительновысокимсодержаниембелка)врезультатедействияПЕП-Рнаиболеевыраженным было увеличение выхода водорастворимого белка за счётпроявленияактивностипротеазы,а106прииспользованииржи(сырьясотносительно высоким содержанием НКП) использование ПЕП-Р привело ксущественному увеличению выхода ВС вследствие проявления активностикомплекса.ФП ПЕП-Р был эффективен и при воздействии на послеспиртовую барду –увеличение выхода водорастворимого белка составило 37% по отношению кконтролю, а ВС на 229%.
При использовании ФП кислой протеазы Acid Proteaseсодержание водорастворимого белка повысилось на 58%, а ВС на 114%.Применение ФП ксиланазы Палпфором 2 привело к увеличению ВС на 171%, абелка на 21%. Увеличенный выход водорастворимого белка при применении ФПAcid Protease возможно связан с более высокой активностью ФП Acid Protease прирН 4,0 (естественный рН суспензии сухой послеспиртовой барды в концентрации50 мг/см3) по сравнению с ПЕП-Р.Таким образом, в опытах in vitro комплексный ФП ПЕП-Р, полученный наоснове нового рекомбинантного штамма P. canescens Pep-4, обладающий какпротеазной, так и гемицеллюлазной активностями, эффективно гидролизовалбелки и НКП зернового сырья, а также зерновой послеспиртовой барды,обеспечивая существенное увеличение выхода водорастворимых белка и сахаров.Наличие в препарате протеаз и гемицеллюлаз (в первую очередь – ксиланаз)обусловило более высокую эффективность использования ФП ПЕП-Р привоздействии на зерновое сырьё по сравнению с ФП, обладающих каким-либоодним видом активности – только протеазной или только ксиланазной.Проведенные исследования показали целесообразность применения ФП ПЕП вкачестве кормовой добавки при использовании кормов на основе зерновыхкультур.3.5.3 Результаты испытаний in vitro ферментных препаратов сериновойпротеазы P.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
