Диссертация (1152193), страница 12

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 12)

Вкислой зоне рН от 3,0 до 6,0 протеолитическую активность определяли поотношению к гемоглобину, а в щелочной зоне рН от 7,0 до 12,0 – по отношению кказеинату натрия, используя 0,1М универсальный буфер.Определение оптимумов температуры (30–90°С) проводили, используя0,1М карбонатно-бикарбонатный буфер, при pH 10,0, измеряя активностьсериновой протеазы по отношению к казеинату натрия. Оптимальными считалирН и температуру, при которых сериновая протеаза проявляла не менее 80%активности от максимальной.74Рисунок 15 – Профили рН- и температурной зависимости сериновой протеазыштамма P. canescens Oryzin-25Оптимум действия сериновой протеазы наблюдали при 40°С и рН 9,0–10,0,при увеличении рН выше значения рН-оптимума происходило резкое снижениеПС.

В области нейтральных значений рН 6,0–7,0 сериновая протеаза сохранялаболее 50% активности, при рН 8,0 фермент проявлял около 70% отмаксимального значения ПС. В слабокислой области при рН 5,0 ПС составляет36% от максимальной.Повышение или понижение температуры на 10°С по сравнению стемпературонвым оптимумом приводило к снижению активности сериновойпротеазы на 60 и 45%, соответственно.Учитываяполученныеданные,дальнейшиеизмеренияактивностисериновой протеазы производили в оптимуме действия фермента – при рН 10,0 и40°С.3.1.4.2 Индукция биосинтеза сериновой протеазы штаммом P.

canescensOryzin-25 при глубинном культивированииДля исследования возможности индуцирования биосинтеза сериновойпротеазы шт. P. canescens Oryzin-25 при глубинном культивировании, вферментационную среду вносили в качестве индукторов казеинат натрия,75панкреатический гидролизат казеина,пептон,атакжесоевую мукувконцентрации 2%. Данная концентрация была выбрана на основании результатовпредварительных опытов по оптимизации ферментационных сред.После 6 суток ферментации были отобраны пробы КЖ для анализаактивности сериновой протеазы и концентрации белка.

Результаты представленыв таблице 13.Индуцирующим эффектом обладали соевая мука и пептон – при введенииих в состав ферментационных сред уровень активности сериновой протеазыувеличивался на 50% и 13%, соответственно. Казеинат натрия не влиял напроцесс синтеза целевого фермента, внесение панкреатического гидролизатаказеина приводило к снижению протеолитической активности.Таблица 13 – Влияние индукторов в составе ферментационной среды на синтезщелочной протеазы штаммом P.

canescens Oryzin-25 (колбы, 144 ч, 30℃)ПС, ед./см3ИндукторрНрН 10,0, 40℃казеинат натрияБелок,мг/см3Без индуктораКазеинат натрияГидролизат казеинапанкреатическийПептонСоевая мука6,00,17,70,0716,01,011,30,713,00,415,00,37,00,0715,21,312,30,56,70,16,60,218,11,024,02,513,60,719,41,2На основании полученных результатов для проведения дальнейшихисследований была выбрана модифицированная ферментационная среда с 2%соевой муки, на которой было проведено культивирование штамма P.

canescensOryzin-25,атакжештаммаP.canescensOryzin-3,полученнымприкотрансформации реципиентного штамма P. canescens RN3-11-7 niaD- тремяцелевыми плазмидами, несущими гены ПЕП, ЛАП и сериновой протеазы(таблица 14).76Таблица 14 – Сравнение активности сериновой протеазы и ксиланазы новыхрекомбинантных штаммов при культивировании на модифицированнойферментационной среде (колбы, 144 ч, 30ºС)ПС, ед./см3ШтаммP. canescensOryzin-3P. canescensOryzin-25КсА,ед./см3Белок,мг/см3рН 10,0, 40℃казеинатнатриярН 5,0, 50℃6,50,07181,821,91,72184,06,20,0718,61,722,21,324012рННа основании полученных результатов для дальнейших исследований былвыбран штамм P.

canescens Oryzin-25, обладающий протеолитической иксиланазной активностью.Таким образом, в результате трансформации плазмидой pPrXEG_alcPr_AorбылполученрекомбинантныйштаммP.canescensOryzin-25,которыйпродуцирует сериновую протеазу (22 ед./см3), сохраняя при этом собственнуюксиланазную активность (245 ед./см3). Подобран состав ферментационной среды,содержащей дополнительно 2% соевой муки, способствующий повышениюпротеолитической активности штамма в 1,5 раза.3.1.5 Исследование стабильности полученных рекомбинантных штаммовпри последовательных пересевахИсследования стабильности полученных новых рекомбинантных штаммов –продуцентов целевых ферментов включали в себя выбор агаризованной среды,обеспечивающейравномерныйростмицелия,накоплениедостаточногоколичества биомассы и сохранение активного посевного материала. Пересевыпроводили в соответствии со схемой, представленной на рисунке 16.77Штамм на средеPM+NaNO3вторичная проверкатрансформантовКонтрольсредаPM+NaNO31 пассаж2 пассажчерез 3 месяцасредаPM+NaNO3средаPM+NaNO3среда SMсреда SMсреда САсреда САРисунок 16 – Схема опыта по выбору агаризованной среды для сохраненияактивностей новых рекомбинантных штаммовПоследовательные пересевы штаммов (ведение посевного материала)осуществляли на трех видах агаризованных сред: на минимальной средеРМ+NaNO3, применяемой для отбора трансформантов, среде SM, содержащейглюкозу, дрожжевой экстракт и KH2PO4, и среде СА, в состав которой входилоагаризованное сусло плотностью 7°Б.

Штаммы пересевали «уколом» на чашкиПетри на указанных агаризованных средах и инкубировали при 30°С в течение 6суток. По истечении срока инкубирования штаммы сравнивали по интенсивностироста и морфологии мицелия (рисунки 17, 18 и 19). Штаммы также проверяли настабильность по признаку биосинтеза целевых ферментов при культивировании вкачалочных колбах (таблицы 15, 16 и 17).78Таблица 15 – Влияние состава агаризованной среды на сохранение активностипри пересевах штамма P. canescens Pep-4 – продуцента пенициллопепсина (колбы,144 ч, 30℃)Вариантыагаризованных средКонтрольРМ + NaNO3ПС, ед./см3КсА, ед./см3рН 4,7, 30℃гемоглобин1108,7рН 5,0, 50℃Белок,мг/см323021,1171,722321230152005171,5191,5192200202101218014171,5181,21921 пассажРМ + NaNO3SMСА1005,01044,9989,02 пассажРМ + NaNO3SMСАРМ + NaNO311061204,8957,5SMСАРисунок 17 – Колонии штамма P. canescens Pep-4 – продуцентапенициллопепсина на различных агаризованных средах (144 ч, 30ºС)79Таблица 16 – Влияние состава агаризованной среды на сохранение активностипри пересевах штамма P.

canescens RN3-11-7-7 – продуцента пенициллопепсина илейцинаминопептидазы (колбы, 144 ч, 30℃)ВариантыагаризованныхсредКонтрольПС, ед./см3РМ + NaNO3SMСА602,5708,5605РМ + NaNO3SMСА575653559РМ + NaNO3рН 4,7, 30°Сгемоглобин642,5КсА, ед./см3ЛАПА, ед./см3рН 5,0, 50℃рН 5,0, 30℃Белок,мг/см323020,11 пассаж230122111622092 пассаж21010210102058,7252,4141,5303,7334,9353142141141,5303,536,55363131,2151,7141,5SMСАРисунок 18 – Колонии штамма P. canescens RN3-11-7-7 – продуцентапенициллопепсина и лейцинаминопептидазы на различных агаризованных средах(144 ч, 30℃)80Таблица 17 – Влияние состава агаризованной среды на сохранение активностипри пересевах штамма P. canescens Oryzin-25 – продуцента сериновой протеазы(колбы, 144 ч, 30℃)ПС, ед./см3ВариантыагаризованныхсредКонтрольКсА, ед./см3рН 10,0, 40℃казеинат натрия221,3рН 5,0, 50℃Белок,мг/см32401218,51,7243152452525030181,7181,5192245152501524018181,7191,5161,21 пассажРМ + NaNO3SMСА232,5232,6162,52 пассажРМ + NaNO3SMСА191,5232,861,2РМ + NaNO3SMСАРисунок 19 – Колонии штамма P.

canescens Oryzin-25 – продуцента сериновойпротеазы на различных агаризованных средах (144 ч, 30℃)Очевидно, что оптимальной агаризованной средой для выращиванияпосевного материала новых рекомбинантных штаммов является среда SM,поскольку при использовании данной среды посевной материал приводил кстабильным и высоким результатам по биосинтезу целевых ферментов. Крометого,колонии,выращенныенасреде81SM,имеютболееинтенсивноеспороношение по сравнению с колониями на среде СА и характеризуютсябольшим накоплением биомассы по сравнению с минимальной средой.Далее была определена стабильность уровня биосинтеза протеаз придлительном хранении штаммов на выбранной агаризованной среде (SM).

Штаммыхранили на скошенном агаре и пересевали каждые 3 месяца, в общей сложностиштаммы прошли не менее 5 последовательных пассажей. После каждого пассажаштаммы культивировали в качалочных колбах на ферментационной среде (составпредставлен в разделе 2.5), после окончания ферментации в КЖ определялиактивности по отношению к гемоглобину (в случае Pep-4 и RN3-11-7-7),казеинату натрия (в случае Oryzin-25) и L-лейцин-паранитроанилиду (в случаеОтносительная активность ПС,ЛАПА, %RN3-11-7-7).

Результаты представлены на рисунке 20.1401201001 пассаж802 пассаж603 пассаж404 пассаж5 пассаж200ПЕПPep-4ПЕПЛАПRN3-11-7-7ОризинOryzin-25Рисунок 20 – Уровни активности в культуральной жидкости протеазрекомбинантных штаммов при последовательных пересевах в процессе хранения(культивирование в колбах)Из представленных данных на рисунке 20 видно, что активность ПЕПштамма Pep-4 в процессе хранения и последовательных пересевов была выше на 15% по сравнению с первым пассажем; активность ПЕП штамма RN3-11-7-7 –находилась на уровне контрольного значения (91–93% от первого пассажа),82активность ЛАП штамма RN3-11-7-7 – была выше на 10–20% от первого пассажа;активность Оризина штамма Oryzin-25 – сохранялась на уровне контроля.Следовательно, полученные трансформанты не теряли активности после 5пересевов в течение 1,5 лет.Таким образом, полученные данные свидетельствуют о стабильности новыхрекомбинантных штаммов по признаку биосинтеза протеаз при использованиидля хранения посевного материала (пассажирования) агаризованной среды SM.3.2 Получение сухих ферментных препаратов на основе новыхрекомбинантных штаммов P.

canescens3.2.1 Получение сухого ферментного препарата пенициллопепсина на основештамма P. canescens Pep-4КультивированиештаммаP.canescensPep-4проводилив10-ллабораторном ферментере АНКУМ-10 имеющего геометричекий объём 10 дм3 ирабочий объём 7 дм3 (ИБФМ им. Г.К.

Скрябина РАН, Пущино), оснащенномсистемой автоматического регулирования рН, рО2 и температуры, а такжебарботерами для подачи воздуха и двухъярусной мешалкой.Получение инокулята и культивирование проводили на ферментационнойсреде, состав которой представлен в разделе 2.5. В качестве пеногасителя передстерилизацией вносили 0,5% Пропинол Б-400.Ферментерзасеваливегетативнымпосевнымматериалом(ВПМ),полученным следующим образом: споровой суспензией рекомбинантного штаммаP. canescens Pep-4 со средним значением ПС 120 ед./см3 (по гемоглобину)засевали колбы с ферментационной средой и выращивали при постоянномперемешивании 250 об/мин в течение 24 ч при 28–30℃.Параметры культивирования: Количество ВПМ – 10%; Температура культивирования – 28℃;83 рН – естественный; Расход воздуха – 3,5 дм3/мин; Продолжительность культивирования 120 ч.Каждые 12 ч отбирали пробы КЖ и после удаления биомассы определялиобщую протеолитическую активность и концентрацию растворимого белка(таблица18).ВпроцессеферментациирегистрировалисьрО2ирН.Интенсивность аэрации регулировали изменением скорости перемешивания.Таблица 18 – Результаты ферментации рекомбинантного штамма P.

Характеристики

Список файлов диссертации