Диссертация (1152193)
Текст из файла
ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТПИЩЕВОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ –филиал Федерального государственного бюджетного учреждения наукиФедерального исследовательского центра питания, биотехнологии и безопасностипищи (ВНИИПБТ – филиал ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»)На правах рукописиВЕЛИКОРЕЦКАЯ Ирина АлександровнаСОЗДАНИЕ НОВЫХ КОМПЛЕКСНЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВГРИБНЫХ ПРОТЕАЗ НА ОСНОВЕ ШТАММА PENICILLIUM CANESCENSДЛЯ ЭФФЕКТИВНОЙ КОНВЕРСИИ БЕЛОКСОДЕРЖАЩЕГОРАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯСпециальность 05.18.07 – Биотехнология пищевых продуктов и биологическиактивных веществДиссертация на соискание ученой степени кандидата технических наукНаучный руководительд.х.н., проф.
Синицын А.П.Москва – 2019ОГЛАВЛЕНИЕВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................. 61ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ ...................................................... 131.1 Протеолитические ферменты .............................................................................
131.1.1 Экзопептидазы ................................................................................................. 151.1.2 Эндопептидазы ................................................................................................. 181.2 Применение протеолитических ферментов при гидролизе растительногобелоксодержащего сырья........................................................................................... 241.2.1 Основные виды белоксодержащего растительного сырья ............................
241.2.1.1 Характеристика зернового сырья................................................................. 241.2.1.2 Характеристика бобового сырья .................................................................. 291.2.2 Применение протеолитических ферментов при переработке растительногосырья ........................................................................................................................... 311.3 Грибные продуценты протеаз .............................................................................
351.4 Подходы к получению грибных рекомбинантных продуцентов ...................... 391.4.1 Использование мицелиальных грибов для продукции рекомбинантныхбелков.......................................................................................................................... 391.4.2 Создание экспрессионной системы на основе штамма P. canescens ............
421.4.2.1 Выбор селективного маркера для штамма P. canescens ............................. 421.4.2.2 Идентификация и выделение сильных промоторов для экспрессии генов ........................................................................................................................... 45ЗАКЛЮЧЕНИЕ .......................................................................................................... 472ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.................. 482.1 Штаммы-микроорганизмы ..................................................................................
482.2 Используемые плазмидные конструкции .......................................................... 492.3 Получение плазмидных конструкций ................................................................ 492.4 Получение протопластов и трансформация реципиентного штамма ............... 512.4.1 Получение компетентных клеток реципиентного штамма P. canescens RN311-7 niaD- .................................................................................................................... 512.4.2 Трансформация ................................................................................................ 5222.4.3 Рассев протопластов на агаризованные среды ...............................................
522.5 Среды для культивирования штаммов ............................................................... 532.6 Ферментные препараты....................................................................................... 542.7 Субстраты ............................................................................................................ 542.8 Определение активности ферментов .................................................................. 542.9 Определение концентрации белка ...................................................................... 562.10 Электрофорез в полиакриламидном геле ....................................................... 562.11 Определение рН- и температурных оптимумов ферментных препаратов ....
562.12 Определение термостабильности ферментных препаратов .......................... 572.13 Анализ компонентного состава ферментных препаратов ............................. 572.14 Методы анализа сусла и бражки ..................................................................... 582.15 Структура экспериментальных исследований ............................................... 583РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ...............................................................
603.1 Получение рекомбинантных штаммов ............................................................... 603.1.1 Создание продуцента пенициллопепсина – трансформация штамма P.canescens RN3-11-7 niaD- плазмидой pPrXEG_PEP ................................................. 603.1.2 Создание продуцента пенициллопепсина и лейцинаминопептидазы –котрансформация штамма P. canescens RN3-11-7 niaD- плазмидами pPrXEG_PEP иpPrAbf_Lap .................................................................................................................
653.1.3 Создание продуцента комплекса протеаз – котрансформация штамма P.canescens RN3-11-7 niaD- плазмидами pPrXEG_alcPr_Aor, pPrXEG_PEP иpPrAbf_Lap1 ............................................................................................................... 673.1.3.1 Оптимизация методики электрофоретического анализа культуральнойжидкости трансформантов P. canescens, имеющих активность сериновой протеазы........................................................................................................................
703.1.4 Создание продуцента сериновой протеазы – трансформация штамма P.canescens RN3-11-7 niaD- плазмидой pPrXEG_alcPr_Aor ........................................ 723.1.4.1 Профили рН- и температурной зависимости активности сериновойпротеазы штамма P. canescens Oryzin-25 .................................................................. 7433.1.4.2 Индукция биосинтеза сериновой протеазы штаммом P.
canescens Oryzin25 при глубинном культивировании ......................................................................... 753.1.5 Исследование стабильности полученных рекомбинантных штаммов припоследовательных пересевах ..................................................................................... 773.2 Получение сухих ферментных препаратов на основе новых рекомбинантныхштаммов P.
canescens ................................................................................................. 833.2.1 Получение сухого ферментного препарата пенициллопепсина на основештамма P. canescens Pep-4 ........................................................................................ 833.2.2 Получение сухого ферментного препарата пенициллопепсина илейцинаминопептидазы на основе штамма P.
canescens RN3-11-7-7 ..................... 853.2.3 Получение сухих комплексных ферментных препаратов протеаз на основерекомбинантных штаммов P. canescens ................................................................... 873.3 Масштабирование процесса культивирования рекомбинантных штаммов вусловиях промышленного производства .................................................................. 893.4 Свойства и состав ферментных препаратов, полученных с помощью новыхрекомбинантных штаммов P. canescens ................................................................... 923.4.1 рН и температурные оптимумы целевых активностей .................................. 923.4.2 Термостабильность ферментов ....................................................................... 933.4.3 Компонентный состав ферментных препаратов ............................................
953.5 Прикладные испытания новых ферментных препаратов, полученных спомощью рекомбинантных штаммов ..................................................................... 1003.5.1 Исследование эффективности применения ферментного препаратапенициллопепсина и лейцинаминопептидазы для интенсификации спиртовогоброжения ................................................................................................................... 1003.5.2 Результаты испытаний in vitro ферментного препарата Пенициллопепсина вкачестве кормовой добавки на зерновом сырье ..................................................... 1043.5.3 Результаты испытаний in vitro ферментных препаратов сериновой протеазыP.
canescens в качестве кормовой добавки на соевом сырье ................................. 1073.5.4 Результаты испытаний in vivo комплексных ферментных препаратов повлиянию на продуктивность и физиологическое состояние свиней при откорме 11143.5.4.1 Расчет экономической эффективности производства свинины сиспользованием новых ферментных препаратов в составе комбикормов ............ 114ВЫВОДЫ ................................................................................................................. 117СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ......................................................................................
119СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................ 121ПРИЛОЖЕНИЯ ........................................................................................................ 1375ВВЕДЕНИЕАктуальность темы исследования. В настоящее время пищевая иперерабатывающая промышленность Российской Федерации является одной изстратегическихотраслейэкономики,обеспечивающейнаселениестранынеобходимыми качественными продуктами питания. В России разработана иреализуется Стратегия развития пищевой и перерабатывающей промышленностиРоссийской Федерации на период до 2020 года, нацеленная на созданиенеобходимых условий для модернизации промышленности, формирование новоготехнологического уклада, повышение технического уровня производства за счетиспользования современных достижений научно-технического прогресса, а такжерешениепроблемынеобходимостьимпортозамещения.внедренияновыхСредитехнологийпоставленныхвотраслизадач–пищевойиперерабатывающей промышленности, в том числе биотехнологий, позволяющихзначительно расширить выработку продуктов нового поколения с заданнымикачественными характеристиками, повысить глубину переработки, что позволитувеличить выход готовой продукции с единицы перерабатываемого сырья [1].Однимизвидовсырьяпищевойпромышленностиявляетсябелоксодержащее растительное сырье.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
