Диссертация (1152193), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Классификация MEROPS имеет иерархическийпорядок. В зависимости от механизма действия и строения активного центравыделяют шесть классов протеолитических ферментов: A – аспартатные, S –сериновые, C – цистеиновые, G – глутаминовые, T – треониновые, M –металлопептидазы и U – пептидазы с неизвестным механизмом катализа.Протеазы объединены в семейства, на основании гомологии аминокислотныхпоследовательностей, а семейства в свою очередь объединены в кланы, наосновании эволюционного происхождения и укладки молекулы [14–16].1.1.1 ЭкзопептидазыЭкзопептидазыпредставляютсобойферменты,последовательнорасщепляющие пептидные связи, ближайшие к амино- или карбоксильному концумолекулы субстрата [3] (рисунок 1).Рисунок 1 – Механизм действия экзопептидазЭкзопептидазы классифицируются, главным образом, на основании ихмеханизмадействиянасубстрат:аминопептидазы,карбоксипептидазы,дипептидазы и омегапептидазы.АминопептидазысвободныйN-конецили-аминоацилпептидгидролазыполипептидной15цепи,действуютвысвобождаянаотдельныеаминокислотные остатки, ди- и трипептиды.
Большинство аминопептидазотноситсяк металлоферментам,длякаталитического действия,которыхнеобходимо присутствие в активном центре катионов таких металлов, как цинк,кобальт,марганец,магнийиликальций.Аминопептидазыширокораспространены среди бактерий, грибов, растений и млекопитающих [17, 18]. Ониспецифически отщепляют аминоконцевой остаток полипептидной цепи ивключены в метаболизм биологически активных пептидов, таких как гормоны,нейромедиаторы, пищевые пептиды. Они участвуют также в таких биологическихпроцессах, как активация и созревание белков, удаление аномальных белков [19].Эти ферменты экспрессируются как мембранные или цитозольные, либо могутсекретироватьсяизклеток.Специфичностьаминопептидазопределяетсяспособностью гидролизовать кислые, основные или нейтральные N-концевыеостатки [2].Одной из наиболее известных и широко применяемых аминопептидазявляется лейцинаминопептидаза (ЛАП), которая предпочтительно катализируетгидролиз остатков лейцина с амино-конца белковых или пептидных субстратов[20].
В микроорганизмах ЛАП являются транскрипционными репрессорами дляконтроля биосинтеза пиримидина и токсинов, а также для сайт-специфичныхрекомбинацийвплазмидахифагах.ЛАПявляютсяцинк-зависимымиметаллопептидазами. Некоторым ЛАП для максимальной активности требуетсякатион кобальта. рН-оптимум действия большинства ЛАП находится в зоне pH6,0–9,0 [21]. Как правило, микробные ЛАП являются внутриклеточными, однаковнеклеточные ферменты были обнаружены в мицелиальных грибах, в частности,в A. oryzae. Некоторые ЛАП отличаются повышенной термостабильностью,молекулярнаяосновакоторойзаключаетсявнесколькихминорныхмодификациях, таких как стабилизация пептидных концов белка или замещениеводородных связей, требующихся для поддержания структуры, ионными связямис более высокой энергией [22].Способность грибных аминопептидаз высвобождать отдельные N-концевыеаминокислоты, так же, как и их термостабильность, делает их перспективными16для контроля степени гидролиза и развития вкуса различных белковых субстратов[23].
Так как интенсивность горечи пептида пропорциональна количествугидрофобных аминокислот на его N-конце, ЛАП используют для удаленияединичных или пары гидрофобных аминокислот с N-конца полипептидной цепипри снятии горечи белковых гидролизатов [24]. ЛАП также усиливают вкус засчет высвобождения аминокислот [25]. Аминопептидазы придают характернуютекстуру и вкус тесту, мясу и сыру [26]. ЛАП используются при производствесыра, в хлебопечении и при приготовлении соевых гидролизатов [27].Карбоксипептидазы действуют наС-конец полипептидной цеписвысвобождением отдельных аминокислот или дипептидов.
По структуреактивного центра карбоксипептидазы делят на три основные группы: сериновые,металлокарбокси- и цистеиновые. Сериновые карбоксипептидазы, выделенные изPenicillium spp., Saccharomyces spp. и Aspergillus spp., сходны по субстратнойспецифичности, но несколько отличаются по другим свойствам, таким как рНоптимум, стабильность, молекулярный вес и отношение к действию ингибиторов.Для активности металлокарбоксипептидаз из Saccharomyces spp. и Pseudomonasspp.
необходимо присутствие катионов цинка и кобальта [2, 28].Дипептидазы специфично расщепляют пептидные связи на свободныеаминокислоты только в дипептидах. К ним относятся дипептидаза А имембранные дипептидазы [14].Омегапептидазы образуют группу экзопептидаз, которые не имеютпредпочтений в отношении свободного N- или С-конца в субстрате. Несмотря наотсутствие потребности в заряженной концевой группе, они часто действуютблизко к одному или другому концу, и, таким образом, совершенно отличны отэндопептидаз. Омегапептидазы удаляют концевые замещенные, циклические илисвязанные изопептидной связью (отличной от связи между α-карбокси и αаминогруппами) аминокислотные остатки. Примеры омегапептидаз – убиквитингидролазы,пептидил-глицинамидаза,пироглутамил-пептидазы,формилметинил-пептидаза и гамма-глутамил гидролазы [12, 14].17N-1.1.2 ЭндопептидазыЭндопептидазыпредпочтительногидролизуютпептидныесвязинавнутренних участках полипептидной цепи (рисунок 2).Рисунок 2 – Механизм действия эндопептидазРазделение эндопептидаз на подгруппы, прежде всего, основано наструктуре каталитического центра.
По данному признаку их делят на пятьподгрупп:сериновые,цистеиновые,аспартатные,треониновыеиметаллоэндопептидазы.Сериновые эндопептидазы (КФ 3.4.21) составляют около трети всехизвестных протеаз и участвуют во многих биологических процессах [29]. Онисодержат в активном центре триаду а.о.: серин (Ser, нуклеофил), аспарагиновуюкислоту (Asp, электрофил) и гистидин (His, основание).
Нуклеофильная сериноваягруппа в активном центре необходима для связывания с субстратом ирасщепления пептидной связи [30]. Сериновые протеазы характеризуютсяширокой субстратной специфичностью, проявляют пептидазную, эстеразную иамидазную активности. Активны в нейтральной и щелочной зоне рН с оптимумомрН 7,0–11,0 [3]. Сериновые протеазы катализируют двустадийную реакциюгидролиза с образованием ковалентно-связанных промежуточных комплексовфермент-пептид, при этом происходит потеря аминокислоты или фрагментапептида.Заэтапомацилированияследуетпроцессдеацилирования,заключающийся в нуклеофильной атаке промежуточного продукта водой, в18результате чего происходит гидролиз субстрата [2]. Серин активного центрабольшинства сериновых протеаз ингибируется диизопропилфторфосфатом (ДФФ)и фенилметансульфонилфторидом (ФМСФ) [31].
Эти ингибиторы так жеиспользуются для установления принадлежности протеаз к сериновому типу.Однако ДФФ неудобен в использовании из-за его токсичности, поэтому чащевсего используют ФМСФ, так как в растворенном состоянии он малотоксичен[12].По базе данных MEROPS сериновые протеазы разделяют на 37 семейств,которые сгруппированы в 13 кланов [14]. Наиболее широко распространенысериновые эндопептидазы двух основных кланов: химотрипсин-подобные (кланРА), включающие около 300 протеаз [30], и субтилизин-подобные (клан SB),включающие 91 протеазу.
Структура активного центра данных эндопептидазаналогична, но трехмерные структуры различаются, что указывает на ихконвергентнуюэволюцию.Химотрипсин-подобныеферментыуложенывдвойную β-бочку, а субтилизин-подобные ферменты имеют трехслойнуюструктуру β-сэндвич [32].Основными представителями клана РА являются химотрипсины (семействоS1), составляющие самую большую группу протеаз [33]. Каталитическая триадааминокислот для протеаз семейства S1 имеет следующий порядок His/Asp/Ser[34]. Характерным признаком химотрипсинов является наличие дисульфидныхмостиков, способствующих поддержанию правильной конформации молекулыфермента [35].
Биологическая роль химотрипсин-подобных протеаз разнообразна,среди них – ферменты пищеварения (трипсин, химотрипсин, эластаза) [12].Вторую по величине группу сериновых протеаз составляют субтилизины(клан SB), представляющие собой секреторные ферменты, устойчивые и активныев щелочной области рН. В аминокислотном составе молекул субтилизиновпреобладают гидрофобные аминокислоты [32, 36].
Субтилизины проявляютширокую субстратную специфичность, предпочтительно расщепляют связи послегидрофобных а.о. Большинство известных субтилизинов представляют собоймультидоменные полипептиды, состоящие из протеазного домена и одного или19двух сопутствующих, что также объясняет разнообразие их функций [33]. КланSB представлен ферментами двух семейств – субтилизина (S8) и седолизина(S53). Механизм катализа этих семейств различен.
Так, представители семействасубтилизина имеют отличный от сериновых протеаз порядок каталитических а.о.– Asp/His/Ser, а седолизины содержат каталитическую тетраду Glu/Asp/Asp/Ser[12, 20]. Наиболее широко распространено семейство субтилизина (S8) –неспецифические эндопептидазы, к которым относится бактериальная сериноваяэндопептидаза субтилизин (КФ 3.4.21.62) и ее гомологи. Большинство пептидазиз этого семейства синтезируется в виде пре-проферментов, которые проходятчерез клеточную мембрану с помощью сигнального пептида и активируются засчет отщепления пропептида. Они имеют широкий спектр биологическихфункций, в частности, участвуют в процессах питания и процессинге белка [29].Наиболее известными представителями семейства S8 являются субтилизинКарлсберг, продуцируемый Bacillus licheniformis, и субтилизин BPN (илисубтилизин Novo), синтезируемый B.
amyloliquefaciens [2, 37].Большинствосубтилизиновогогрибныхтипа[38].сериновыхНаиболеепротеазотноситсяизвестнойкпротеазамсериновойпротеазоймицелиальных грибов, особенно грибов рода Aspergillus, является оризин (КФ3.4.21.63). По каталитическим свойствам и гомологии вблизи активного центраоризин принадлежит к семейству субтилизина (S8). Оризин гидролизует эластин,коллаген и другие субстраты типичные для субтилизинов. Оптимум действиянаходится в щелочной зоне рН от 8,0 до 10,0. Первичный продукт трансляциисодержит сигнальный пептид из 21 а.к. остатка и пропептид из 10 а.к. остатка (уA.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
