Диссертация (1152193), страница 11
Текст из файла (страница 11)
canescens под ксиланазным промотором; pPrAbf_Lap1, несущей ген lap1 A. oryzae под арабинофуранозидазнымпромотором; pSTA10, несущей маркёрный ген нитратредуктазы niaD.В результате получили 22 трансформанта, из которых методом ПЦР сгеномной ДНК гриба было отобрано шесть (№№ 2, 3, 4, 7, 8 и 21), содержащихоба целевых гена. Тестирование выбранных трансформантов на уровень ПС послекультивирования в качалочных колбах позволило отобрать клон №7 (далее P.canescens RN3-11-7-7) с общей ПС в КЖ 63 ед./см3, а также с активностью ЛАПАв КЖ 24 ед./см3 (таблица 7).Таблица 7 – Протеолитические активности и концентрация белка в культуральнойжидкости отобранных трансформантов штамма P.
canescens (колбы, 144 ч, 30ºС)ПС, ед./см3ТрансформантКонтрольP. canescens RN311-7 niaDcl 2cl 3cl 4cl 7cl 8cl 21ЛАПА, ед./см3рН 5,0, 30CБелок,мг/см30,909,66,00,40,363,02,84,6181411249810,010,69,413,09,49,4рН 4,7, 30C,гемоглобин65КЖ отобранных трансформантов была проанализирована с помощью ДДСЭФ, на электрофореграмме (рисунок 11) было обнаружено две полосы смолекулярными массами 42–45 и 37 кДа, принадлежащие целевым белкам: ПЕП иЛАП, соответственно.PepLapXylРисунок 11 – Электрофореграмма культуральной жидкости трансформантов (cl2,cl3, cl4, cl7, cl8, cl21) и исходного штамма (RN3)Отобранный трансформант P. canescens RN3-11-7-7 подвергли вторичнойпроверке с помощью культивирования в качалочных колбах, полученные данныеподтвердили высокий уровень ПС в КЖ штамма (64 ед./см3) и наличиеактивности в ЛАП в КЖ (таблица 8), которые практически совпадали с данными,полученными при первичном отборе трансформантов.
При этом трансформантпроявил высокую ксиланазную активность (230 ед./см3 при активностиреципиентного штамма 250 ед./см3).Таблица 8 – Целевые активности и концентрация белка в культуральной жидкостиштаммов P. canescens RN3-11-7-7, (колбы, 144 ч, 30ºС)ПС, ед./см3ШтаммКонтрольрН 4,7, 30C,гемоглобинЛАПА,ед./см3КсА,ед./см3рН 5,0, 30CрН 5,0, 50ºС1,00,20,025025,866Белок,мг/см310,01,2P. canescens RN3-11-7niaDP.
canescens RN3-11-7-764,02,5252,423020,114,01,5Таким образом, в результате котрансформации плазмидами pPrXEG_PEP иpPrAbf_Lap1 был создан рекомбинантный штамм P. canescens RN3-11-7-7 –высокоактивный продуцент комплекса эндо- и экзопептидаз – ПЕП (64 ед./см3 вКЖ) и ЛАП (25 ед./см3 КЖ), который сохранил способность к активномубиосинтезу собственной ксиланазы (230 ед./см3 КЖ).3.1.3 Создание продуцента комплекса протеаз – котрансформация штаммаP. canescens RN3-11-7 niaD- плазмидами pPrXEG_alcPr_Aor,pPrXEG_PEP и pPrAbf_Lap1На основании предыдущих опытов по успешной одновременной экспрессиив штамме P. canescens двух генов протеаз – ПЕП и ЛАП были проведеныисследования по котрансформации реципиентного штамма тремя плазмидами сцелью добавления сериновой щелочной протеазы из A.
oryzae к имеющемусяпротеолитическому комплексу.Реципиентный штамм P. canescens RN3-11-7 niaD- котрансформировалитремя плазмидами: pPrXEG_alcPr_Aor, несущей ген alp под ксиланазным промотором; pPrXEG_PEP, несущей ген pepA под ксиланазным промотором; pPrAbf_Lap1, несущей ген lap под арабинофуранозидазным промотором; pSTA10, несущей маркёрный ген нитратредуктазы niaD.Было получено 12 трансформантов, которые пересеяли на селективнуюсреду РМ с NaNO3 для первоначального скрининга. Выросшие на селективнойсреде клоны культивировали в качалочных колбах для определения активностейпо отношению к гемоглобину (рН 4,7), казеинату натрия (рН 8,0) и L-лейцин-пнитроанилиду (рН 5,0).
В качестве контроля использовали реципиентный штамм67P. canescens RN3-11-7 niaD-. Полученные результаты (таблица 9) показали, чтоактивность щелочной протеазы в КЖ (по отношению к казеинату натрия) уклонов №№ 3, 6 и 9 увеличилась до 2,4–5,0 ед./см3, т.е., оказалась в 6 раз больше,чем у исходного штамма, а активность ПЕП и ЛАП у всех трансформантов былана уровне контроля.Таблица 9 – Протеолитические активности и концентрация белка в культуральнойжидкости трансформантов P. canescens RN3-11-7 niaD- (колбы, 144 ч, 30ºС)ТрансформантКонтрольP.canescensRN3-11-7niaDcl 1cl 2cl 3cl 4cl 5cl 6cl 7cl 8cl 9cl 10cl 11cl 12ПС, ед./см3ЛАПА,ед./см3ПС, ед./см3рН 4,7, 30°С(гемоглобин)рН 5,0, 30°C(L-лейцин-пнитроанилид)рН 8,0, 30°С(казеинат натрия)Белок,мг/см30,90,30,512,00,90,90,90,90,90,90,90,90,90,90,90,90,30,30,30,30,30,30,30,30,30,30,30,31,70,55,00,50,52,40,50,53,00,50,50,511,011,613,011,511,712,013,014,013,812,813,412,9Результаты ДДС-ЭФ КЖ трансформантов показали (рисунок 12) наличие уклонов №№ 1, 3, 6, 9, 11 и 12 белковых полос с молекулярной массой около 37 и27 кДа, предположительно принадлежащих сериновой щелочной протеазе A.oryzae (достоверность приведенных данных подтверждена последующимиопытами, см.
раздел 3.1.3.1 и приложение А). Белковые полосы, соответствующиемолекулярным массам ПЕП (43 кДа) и ЛАП (37 кДа), на электрофореграмме КЖполученных трансформантов отсутствовали.68У клонов с увеличенной экспрессией сериновой протеазы (№№ 1, 3, 6, 9, 11,12) отсутствовала полоса в области 30 кДа, соответствующая Ксил P. canescens.Возможнымобъяснениемсериновымипротеазамиотсутствиявпроцессеполосы,являетсяпробоподготовкигидролиздляКсилпроведенияэлектрофореза.Следует отметить, что на электрофореграмме КЖ клона №4 отсутствовалибелковые полосы с высокой молекулярной массой, и наблюдалось образование«шмеров», представляющих продукты гидролиза белков. Предположительно, этотакже связано с действием сериновой протеазы.Рисунок 12 – Электрофореграмма культуральной жидкости трансформантовштамма P.
canescens RN3-11-7 niaD-, полученных при котрансформацииплазмидами pPrXEG_alcPr_Aor, pPrXEG_PEP и pPrAbf_LapКлоны№№3и9,обладавшиемаксимальнойпротеолитическойактивностью и продемонстрировавшие на электрофореграмм выраженныеполосы, соответствовавшие молекулярной массе сериновой протеазы, а такжеклон №4 были пересеяны на среду РМ с нитратом натрия для повторнойпроверки.Таким образом, в результате котрансформации штамма P. canescens RN3-117 niaD- тремя целевыми плазмидами, несущими гены сериновой протеазы, ПЕП иЛАП, у полученных трансформантов была обнаружена экспрессия только генасериновой протеазы.
При этом, предположительно, в результате высокой69гидролитической активности сериновой протеазы происходил гидролиз белков вусловиях электрофоретического анализа белкового состава КЖ, что указывает нанеобходимость оптимизации методики пробоподготовки перед проведениемДДС-ЭФ.3.1.3.1Оптимизация методики электрофоретического анализакультуральной жидкости трансформантов P. canescens, имеющих активностьсериновой протеазыДля стабилизации белков КЖ при проведении ДДС-ЭФ используютразличныеспособыинактивациипротеаз:изменениерН,температуры,использование специфических ингибиторов [137].С целью исследования белкового состава КЖ полученных трансформантовP. canescens, имеющих активность сериновой протеазы, было проведеноглубинное культивирование отобранных клонов №№ 3, 4 и 9 (см.
предыдущийраздел) в качалочных колбах на стандартной ферментационной среде. В качествеконтроля использовали реципиентный штамм P. canescens RN3-11-7 niaD-. Дляопределения активности сериновой протеазы, концентрации белка и проведенияДДС-ЭФ пробы КЖ отбирали в динамике, начиная с 3 суток роста. Активностьсериновой протеазы оценивали, измеряя ПС, используя в качестве субстратаказеинат натрия (рН 8,0, 30℃). Результаты представлены в таблице 10.Таблица 10 – Динамика синтеза сериновой щелочной протеазы в культуральнойжидкости трансформантов P.canescens (колбы, 144 ч, 30℃)Времяроста,суткиКонтрольP.canescens RN311-7 niaDПСБелокклон 3ПСБелок70клон 4ПСБелокклон 9ПСБелок34560,50,50,50,5101010122,43,45,05,2111312121,11,51,71,871312121,72,22,43,61091010Максимальную активность сериновой протеазы в КЖ трансформантовнаблюдали на 6 сутки культивирования.
Наиболее высокую активность – 5,2ед./см3, показал клон №3; у клона №4 наблюдали лишь небольшое увеличениеактивности сериновой протеазы по сравнению с реципиентным штаммом (до 1,8ед./см3).Электрофоретический анализ проводили в пробах КЖ, отобранных на 3 и 6сутки культивирования (рисунок 13).
Пробы центрифугировали, для инактивациисериновой протеазы и стабилизации белков КЖ трансформантов в супернатантыКЖвносилиингибиторсериновыхпротеазфенилметансульфонилфторид(ФМСФ) в количестве 10% от объёма пробы 100мМ раствора (0,0174 г ФМСФ в 1см3 изопропанола) или устанавливали рН 4,0, используя 1Н раствор HCl. КЖтрансформанта № 4 стабилизировали только добавлением ФМСФ (таблица 11).Таблица 11 – Влияние значения рН и внесения ФМСФ на активность сериновойпротеазы в культуральной жидкости трансформантов P. canescens (колбы, 144 ч,30℃)ПС, ед./см3рН 8,0, 30°С, казеинат натрияКЖ, 3 сут. ростаТрансформантP.canescens RN311-7 niaDКлон 3Клон 4Клон 9КЖ, 6 сут. ростарНестеств.рН 4,0ФМСФрНестеств.рН 4,0ФМСФ0,5н.о.н.о.0,5н.о.н.о.2,41,11,71,1н.о.1,50,50,50,55,21,83,63,9н.о.2,00,50,50,571Рисунок 13 – Влияние способа стабилизации образцов КЖ трансформантовP.
canescens на результаты ДДС-ЭФСмещение значения рН КЖ в кислую зону приводило к снижениюпротеолитической активности трансформантов, в среднем, в 1,5–2 раза, но необеспечивало полного ингибирования сериновой протеазы, и соответственно, необеспечивало достаточную стабилизацию белков КЖ при ДДС-ЭФ, чтоподтверждается отсутствием ярко выраженных полос на электрофореграмме(рисунок 13). Только внесение ФМСФ позволило полностью осуществитьингибирование активности сериновой протеазы у трансформантов P.
canescens,что привело к появлению на электрофореграмме (рисунок 13) четких полос,соответствующих сериновой протеазе (37 и 27 кДа) и Ксил (30 кДа)(достоверность приведенных данных подтверждается масспекторометрическиманализом, см.
приложение А).3.1.4 Создание продуцента сериновой протеазы – трансформация штамма P.canescens RN3-11-7 niaD- плазмидой pPrXEG_alcPr_AorНа следующем этапе с целью повышения частоты трансформации штамм P.canescens RN3-11-7 niaD- трансформировали только одной целевой плазмидой –pPrXEG_alcPr_Aor, несущей ген сериновой протеазы,72Было получено 97 трансформантов. Выросшие на селективной среде РМ сNaNO3 трансформанты культивировали в качалочных колбах для скрининга пообщей протеолитической активности, определённой по казеинату натрия вкачестве субстрата (рН 8,0, 30℃). Результаты для наиболее активных вариантовпредставлены в таблице 12.Таблица 12 – Протеолитическая активность и концентрация белка вкультуральной жидкости наиболее активных трансформантов P. canescens (колбы,144 ч, 30℃)ПС, ед./см3ТрансформантрН 8,0,30°С(казеинат натрия)Белок, мг/см30,5102,13,93,53,56,51,31,92,43,1121312121310111111КонтрольP.canescens RN3-11-7 niaD5612222535374951Трансформанты с максимальной активностью (№№ 6, 12, 22 и 25) былиотобраны для анализа с помощью ДДС-ЭФ.
Для стабилизации КЖ припроведении электрофореза сериновую протеазу ингибировали 10% 100мМФМСФ. Данные электрофоретического анализа (рисунок 14) подтвердилиприсутствие в КЖ трансформантов белковых полос с молекулярной массой около37 кДа (преимущественно) и 27 кДа, принадлежащих сериновой протеазе A.oryzae. Для дальнейших исследований был выбран трансформант 25 (далее P.canescens Oryzin-25) с активностью сериновой протеазы в КЖ 6,5 ед./см3.73AlpXylРисунок 14 – Электрофореграмма образцов культуральной жидкости отобранныхтрансформантов, полученных в результате трансформации P.
canescens RN3-11-7niaD- плазмидой pPrXEG_alcPr_Aor3.1.4.1 Профили рН- и температурной зависимости активности сериновойпротеазы штамма P. canescens Oryzin-25С целью определения оптимальных условий действия сериновой протеазынового штамма P. canescens Oryzin-25, в фильтрате КЖ, полученной послекультивирования продуцента в качалочных колбах, были определены профилирН- и температурной зависимости активности этого фермента (рисунок 15).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
