Диссертация (1152193), страница 14
Текст из файла (страница 14)
120 (117–134) ч.Пробы КЖ из ферментеров отбирали через определенные промежуткивремени, в фильтрате КЖ определяли общую протеолитическую активность,активность Ксил и концентрацию растворимого белка (таблица 23). Контрольмикробиологической чистоты осуществляли с использованием общепринятыхметодов.По окончании ферментации отделение биомассы проводили с помощьюфильтр-пресса марки XAZG30 («Zhejiang Longyuan Filter Press», Китай) сфильтрующейповерхностью30м 2.КонцентрированиефильтратаКЖосуществляли на ультрафильтрационной установке Водопад УСП166,8-2-12(«Фильтропор Групп», Россия) со спиральными полимерными мембранами с90фильтрующей поверхностью 166 м3 с порогом отсечения 10 кДа. Сухойконцентрированный ФП получали из УК на распылительной сушилке TALLFORM компании «Fetterteck Ltd.» (Италия) с производительностью по испарённойвлаге до 500 кг/час.
Носителем для приготовления сухого ФП являлся крахмал, вкачестве стабилизатора вносили хлорид натрия в количестве 10%.Таблица 23 – Результаты ферментации рекомбинантных штаммов в условияхпромышленного производстваШтаммP. canescensPep-4P. canescensRN3-11-7-7Времяроста,чР, барt, ℃Засев4554697993103117Засев447086941101151340,410,400,400,400,410,400,410,410,420,410,400,400,380,390,410,4228,328,428,228,428,328,328,527,029,529,829,828,228,228,128,228,2рНИнтенс.перемеш.,%Воздух,м3/ч4,36,26,16,05,55,55,55,54,45,15,45,75,86,06,06,1100100100100100100100100100100100100100100100100221214219220251253248266309375380384392390376379ПС,ед./см3КсА.3рН 4,7, 30℃гемоглобинед./см12,524,840,352,359,464,675,726,035,537,539,447,856,252,660,365,470,670,7146,6182,518465,681,193105,0116,6128,1120,6Белокмг/см34,98,18,410,511,713,014,68,09,610,311,011,712,313,9Характеристика ФП, полученных в результате культивирования новыхрекомбинантных штаммов в промышленном ферментере объемом 10 м3,приведены в таблице 24.ПромышленныеобразцыФПсоответствовалисанитарно-микробиологическим показателям безопасности в соответствии с ТР ТС 029/2012.91Таблица 24 – Характеристика ферментных препаратов, полученных впроизводственных условиях на основе штаммов P.
canescens Pep-4 и RN3-11-7-7рН 4,7, 30℃гемоглобинКсА,ед./см3/гЛАПА,ед./см3/грН 5,0, 50℃рН 6,0, 40°С14,6±0,775,7±4184,0±9-65±4350±181080±50-13,9±0,752,6±2,5120,6±630±275±4235±12670±34340±17Белок,мг/см3/гФПКЖP. canescens Pep-4ПЕПсухой ФПКЖP. canescens RN3-11-7-7ПЕП-ЛАПсухой ФППС,ед./см3/гТаким образом, в условиях завода ООО «Агрофермент», методомраспылительной сушки ультраконцентратов КЖ штаммов P.
canescens Pep-4 и P.canescens RN3-11-7-7 наработанных в 10 м3 промышленных ферментерах, былиполученыопытно-промышленныепартиисухихконцентрированныхкомплексных ФП: ПЕП, содержащий ПЕП (350 ед./г по гемоглобину) и Ксил(1075 ед./г); ПЕП-ЛАП, содержащий ПЕП (235 ед./г по гемоглобину), ЛАП (340ед./г) и Ксил (670 ед./г) (Приложение В).
Способ получения ФП подтверждаетсяпатентом РФ (Приложение Б).3.4 Свойства и состав ферментных препаратов, полученных с помощьюновых рекомбинантных штаммов P. canescens3.4.1 рН и температурные оптимумы целевых активностейДля всех полученных ФП были определены рН и температурные оптимумыактивности по отношению к различным субстратам: гемоглобину (в случае ФППЕП и ПЕП-ЛАП), казеинату натрия (в случае ФП Оризин), L-лейцинпаранитроанилиду (в случае ФП ПЕП-ЛАП), ксилану – для всех ФП (таблица 25).92Максимальная активность кислой протеазы в ФП ПЕП и ПЕП-ЛАПнаблюдали при рН 4,0–5,0 и температуре 50–55℃.
ЛАП проявлял максимальнуюактивность при рН 8,0–9,0 и температуре 70℃. Максимальная активностьсериновой протеазы в ФП Оризин находится в диапазоне рН 9,5–11,0 итемпературы 30–40℃. Максимальная активность по отношению к ксилану былаодинакова во всех ФП и находилась в диапазоне рН 3,5–4,5 и температуры 55–65℃.Таким образом, ФП, полученные различными способами (как лабораторные,так и промышленные), имели одинаковые температурные и рН-оптимумыдействия на соответствующие субстраты, поэтому дальнейшие изучения свойствпроводили на примере промышленных ФП (ПЕП-П и ПЕП-ЛАП-П) илабораторном ФП Оризин.Таблица 25 – рН и температурные оптимумы активности новых ферментныхпрепаратов, полученных на основе рекомбинантных штаммов P.
canescensФППЕП-РРаспылительная сушкаПЕП-АОсаждение ацетономПЕП-ППромышленныйПЕП-ЛАП-АОсаждение ацетономПЕП-ЛАП-ЛЛиофильная сушкаПЕП-ЛАП-ППромышленныйОризинОсаждение ацетономСвойства ФПЛАПАрН-опт. Термоопт.ПСрН-опт.Термоопт.КсАрН-опт. Термоопт.4,0–5,050–55--3,5–4,555–654,0–5,050–55--3,5–4,555–654,0–5,050–55--3,5–4,555–654,0–5,050–558,0–9,0703,5–4,555–654,0–5,050–558,0–9,0703,5–4,555–654,0–5,050–558,0–9,0703,5–4,555–659,5–11,030–40--3,5–4,555–653.4.2 Термостабильность ферментовСтабильность ферментов, входящих в состав ФП определяли по остаточнойактивности после 90 мин инкубирования при температурах от 30 до 70℃ и рН 6,5(рисунок 21).93ФП ПЕП-П и ПЕП-ЛАП-П содержали (одинаковую) кислую протеазу, иимели сходную термостабильность при измерении активности по гемоглобину.Фермент сохранял 100% активность после 90 минут инкубирования притемпературе от 30 до 50℃.
При 60–70℃ происходила практически полнаяинактивация ферментов. Фермент ЛАП сохранял 100% активности только при30℃, при 40℃ сохранял 80% активности, при 50℃ – лишь 40%. При 60–70℃фермент полностью инактивировался.Рисунок 21 – Остаточная активность ферментных препаратов(а) ПЕП-П, (б) ПЕП-ЛАП-П, (в) Оризин после инкубирования в течение 90 мин(рН 6,5)Условия: инкубирование в течение 90 мин, температура 30-70℃, рН 6,5.Условия измерения остаточной активности ФП по отношению к соответствующимсубстратам: ПС ПЕП и ПЕП-ЛАП – по гемоглобину (рН 4,7, 30℃),ПС Оризин – по казеинату натрия (рН 10,0, 40℃),ЛАПА ПЕП-ЛАП – по L-лейцин-паранитроанилиду (рН 5,0, 30℃),КсА – по ксилану березы (рН 5,0, 50℃).Сериновая протеаза в ФП Оризин была стабильна после 90 минутинкубирования при температуре 30–40°С.
При 50℃ осталось 50% от общейактивности. При 60–70℃ фермент полностью инактивировался.Термостабильность Ксил во всех препаратах была одинакова. Ферментсохранял 100% активности при температурах от 30 до 50℃, при 60℃ сохранялосьлишь 12% от активности, при 70℃ происходила полная инактивация фермента.943.4.3 Компонентный состав ферментных препаратовКомпонентный состав ФП был определён с помощью хроматографическогофракционирования с использованием метода анионообменной хроматографиисреднего давления (FPLC) на колонке с носителем Source 15Q.Препараты(10мг),предварительнообессоленныеметодомгель-проникающей хроматографии на носителе Bio-Gel P6, фракционировали наколонке Source 15Q (1 см3) в линейном градиенте 1 M NaCl (20 мМ Bis-Tris/HCl,pH 6.8). На рисунках 22–24 представлены хроматографические профилифракционирования ФП ПЕП-П, ПЕП-ЛАП-П и Оризин.Рисунок 22 – Хроматографический профиль при фракционировании ферментногопрепарата ПЕП-П на колонке с носителем Source 15Q (на хроматограммеприведены номера фракций, а также градиент концентрации NaCl)95Рисунок 23 – Хроматографический профиль при фракционировании ферментногопрепарата ПЕП-ЛАП-П на колонке с носителем Source 15Q (на хроматограммеприведены номера фракций, а также градиент концентрации NaCl)Рисунок 24 – Хроматографический профиль при фракционировании ферментногопрепарата Оризин на колонке с носителем Source 15Q (на хроматограммеприведены номера фракций, а также градиент концентрации NaCl)После хроматографического разделения во фракциях был проведен анализактивности целевых ферментов, фракции также были проанализированы спомощью ДДС-ЭФ.
На рисунках 25–27 представлены электрофореграммыфракций с идентификацией качественного состава ФП.96Рисунок 25 – Электрофореграмма фракций после анионообменной хроматографииферментного препарата ПЕП, М-белковые маркеры.Фракции сконцентрированы в 10 разАФ 60 кДа – α-L-арабинофуранозидазаРисунок 26 – Электрофореграмма фракций после анионообменной хроматографииферментного препарата ПЕП-ЛАП-П, М-белковые маркеры.Фракции сконцентрированы в 20 раз97Рисунок 27 – Электрофореграмма фракций после анионообменной хроматографииферментного препарата Оризин, М-белковые маркеры.Фракции сконцентрированы в 10 раз.В таблице 26 представлен состав новых комплексных ФП, а также составконтрольного ФП на основе штамма P.canescens RN3-11-7 niaD-, полученного иисследованного ранее. Качественный состав компонентов новых ФП определяли,сопоставляя полученные электрофоретические данные по молекулярной массеферментов в хроматографических фракциях и результаты измерения в нихактивностей по отношению к различным специфическим субстратам.
Исходя изобъёма фракций, концентрации белка в них, сопоставляя активности во фракцияхпоотношениюкразличнымсубстратамсудельнымиактивностямисоответствующих ферментов, рассчитывали количественный состав ФП. Крометого, относительное содержание различных белков во фракциях определяли спомощью программы «GelAnalyzer».ВсеисследованныеФПхарактеризовалисьвысокимсодержаниемсоответствующих протеаз (ПЕП P. canescens 43 кДа, ЛАП A. oryzae 37 кДа исериновой протеазы A. oryzae – 37 кДа) – в зависимости от препарата содержаниеэтих ферментов составляло 20–25 % от общего пула белка.
Помимо этого, ФПхарактеризовались относительно высоким содержанием ксиланаз (30 и 25 кДа) –оно варьировало от 18 до 20% от общего пула белка. Кроме того, ФП содержали9825–30% α-L-арабинофуранозидазы 60 кДа (AФ) и АБФА 70 кДа, а также около 2–5% β-1,3-глюканазы (БГЛ).Таблица 26 – Компонентный состав ферментных препаратовСодержание компонентов ферментного препарата,% от общего количества белкаФПКонтрольniaD-КсиланазыАФ,AБФАБГЛПротеазыДругиеферменты47352–5<19–15352–523(ПЕП)17–20252–52032–3530220ПЕП-П(мажор – 30 кДа,минор – 25 кДа)ПЕП-ЛАП-П(мажор – 30 кДа,минор – 25 кДа)Оризин(мажор – 30 кДа,минор – 25 кДа)1815–20*(ПЕП – 16, ЛАП – 4)25-30*(сериновая протеаза)13–28*Сериновая протеаза A.
oryzae фрагментируется на 2 полосы 37 кДа и 25 кДа. Полоса на форезе (25 кДа)соответствует 2 белкам – ксиланазе P. canescens и сериновой протеазе A. oryzae.Таким образом, исследованные ФП характеризовались высоким содержаниемрекомбинантных целевых ферментов протеолитического действия, а такженаличием в их составе комплекса гемицеллюлаз, обладающих активностью поотношению к НКП – ксиланаз, АФ, АБФА, БГЛ.993.5 Прикладные испытания новых ферментных препаратов, полученных спомощью рекомбинантных штаммов3.5.1 Исследование эффективности применения ферментного препаратапенициллопепсина и лейцинаминопептидазы для интенсификацииспиртового броженияПрименение протеолитического ферментного комплекса в спиртовомброжении способствует более полному гидролизу крахмала и белковыхкомпонентов сырья, так как в зерновом сырье крахмальные зерна пронизаныбелковыми веществами [55, 56].
Целесообразно использовать протеолитическиеФП как эндо-, так и экзодействия. В результате применения эндопротеазобразуютсяпептидыразличноймолекулярноймассы.Экзопептидазыгидролизуют белок и пептиды до коротких пептидов и аминокислот. Совместноеиспользованиепротеазпозволяетполучатьсусло,обогащенноелегкоассимилируемым аминным азотом аминокислот, который является источникомпитаниядрожжей,чтоспособствуетповышениюплотностидрожжевойпопуляции, бродильной способности и продуктивности клеток [6].В исследованиях по интенсификации спиртового брожения использоваликомплексный ФП ПЕП-ЛАП (раздел 3.2.2), содержащий кислую протеазу илейцинаминопептидазу.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
