Диссертация (1152193), страница 13

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 13)

canescensPep-4Параметры ферментацииОборотыВремяpO2,мешалки,роста, ч%об/мин0100300123264024327603631600483254060274807232460843142096313901083237012030350ПоокончаниирНРезультаты ферментацииПС, ед./см3Белок,4,24,24,75,15,25,25,25,25,35,35,3ферментациирН 4,7, 30℃гемоглобинмг/см30,00,0111,9372,7579,5735,5117201241015610160101792610,50,99,80,910,00,710,80,711,8212,80,414,01,715,51,816,61,520,31,121,22отделениебиомассыпроводилицентрифугированием. Концентрирование супернатанта КЖ осуществляли наультрафильтрационном аппарате на полых волокнах УФ3-15ПС («Фазеркрафт»,Россия) с порогом отсечения 15 кДа.

Сухой концентрированный ФП получали изультраконцентрата (УК) КЖ на сушильной установке с псевдоожиженным слоемMIDI-GLATT («GLATT Ingenieurtechnik GmbH Weimar», Германия). НосителемдляприготовленияФПслужилпшеничныеотруби,параметрысушки:температура на входе 70–80℃, скорость подачи воздуха 12–17 м3/час, скоростьподачи рабочего раствора – около 3,5 см3/мин.

Температура продукта при подаче84УК – около 23℃, в конце процесса высушивания температура не превышала 39°С.Характеристика полученного сухого ФП ПЕП представлена в таблице 19.Таблица 19 – Характеристика ферментного препарата, полученного на основештамма P. canescens Pep-4ПС,БелокПродуктКсА,рН 4,7,30℃гемоглобинрН 5,0; 50℃мг/см3мг/гед./см3ед./гед./гКЖ(слив из ферментёра)21,21,7-17913,4-н.о.УК73,05-56525-н.о.ПЕП(после распылительнойсушки)-15612-64580122392Таким образом, методом распылительной сушки ультраконцентрата КЖштамма P.

canescens Pep-4, наработанной в 10-л лабораторном ферментере, былполучен экспериментальный образец сухого концентрированного комплексногоФП ПЕП, содержащий ПЕП (645 ед./г по гемоглобину) и Ксил (1223 ед./г).3.2.2 Получение сухого ферментного препарата пенициллопепсина илейцинаминопептидазы на основе штамма P. canescens RN3-11-7-7Культивирование штамма P. canescens RN3-11-7-7 проводили в ЦКП ФИЦБиотехнологии РАН в лабораторной ферментационной установке КФ 104/3 вферментёрах с геометрическим объемом 3 дм3 и рабочим объёмом 1,5 дм3,оснащенных системами автоматического регулирования рН, рО2 и температуры, атакже барботерами для подачи воздуха и двухъярусной мешалкой.Получение инокулята и культивирование проводили на ферментационнойсреде, состав которой представлен в разделе 2.5.

В качестве пеногасителя передстерилизацией вносили 0,1% Лапрола.Ферментер засевали ВПМ, полученным следующим образом: споровойсуспензией рекомбинантного штамма P. canescens RN3-11-7-7 со средним85значением ПС 70 ед./см3 (по гемоглобину) засевали колбы с ферментационнойсредой и выращивали при постоянном перемешивании 250 об/мин в течение 24 чпри 28–30℃.Параметры культивирования: Количество ВПМ – 10% (0,9 дм3 ферментационной среды + 0,1 дм3ВПМ); Температура культивирования – 28±0,2℃; рН – естественный; Расход воздуха – 0,5 дм3/мин; Продолжительность культивирования 168 ч.Каждые 24 ч отбирали пробы КЖ и после удаления биомассы определялиобщую протеолитическую активность, концентрацию растворимого белка,содержание ВС (до 3-х суток), и активность ЛАП (начиная с 3-х суток) (таблица20).

В процессе ферментации регистрировались следующие параметры: рО2,температура, рН. Интенсивность аэрации регулировали изменением скоростиперемешивания.Таблица 20 – Результаты ферментации рекомбинантного штамма P. canescensRN3-11-7-7Параметры ферментацииОборотыВремямешалки, рО2,роста, чоб/мин%0244872961201441682703504704304304304304301008537126110100100Результаты ферментациирН4,14,24,75,35,85,75,96,1Белок,мг/см3ВС,мг/см310,40,3 0,30,039,60,2 1,70,79,60,2 0,40,1409,00,509,61012,02015,22,6017,42,586ПС,ед./см3ЛАПА,ед./см3рН 4,7,30℃гемоглобинрН 5,0, 30℃0,60,0710,52,50,5120,5292,5496,2767,4656,600следы30,5112,5164293393Поокончанииферментацииотделениебиомассыпроводилицентрифугированием.

Концентрирование супернатанта КЖ осуществляли натангенциальной ультрафильтрационной системе («Merck Millipore», США) спределом отсечения 10 кДа. Сухой ФП получали из УК методом лиофильнойсушки на установке Benchtop 9L ES («VirTis», США). Характеристикаполученного ФП ПЕП-ЛАП приведена в таблице 21.Таблица 21 – Характеристика ферментного препарата, полученного на основекультуральной жидкости штамма P.

canescens RN3-11-7-7ПС,рН 4,7, 30℃гемоглобинБелокФПКсА,ЛАПА,рН 5,0, 50℃рН 5,0, 30℃мг/см3мг/гед./см3ед./гед./гед./см3ед./г(слив изферментёра)17,41,1-655-н.о.392,5-УКПЕП-ЛАП60,44-21014-н.о.1368,7--32424--55035КЖ(послелиофильнойсушки)1588132 157331169Таким образом, путём лиофильного высушивания ультраконцентрата КЖштамма P. canescens RN3-11-7-7, наработанной в 3-л лабораторном ферментёре,былполученэкспериментальныйобразецсухогоконцентрированногокомплексного ФП ПЕП-ЛАП, содержащий ПЕП (1588 ед./г по гемоглобину), ЛАП(550 ед./г) и Ксил (15733 ед./г).3.2.3 Получение сухих комплексных ферментных препаратов протеаз наоснове рекомбинантных штаммов P.

canescensНа основе рекомбинантных штаммов P. canescens Pep-4, RN3-11-7-7 иOryzin-25 были получены лабораторные образцы сухих ФП путем осажденияацетоном КЖ. Для этого штаммы культивировали в качалочных колбах объемом750см3; дляштаммаP.canescensPep-4иRN3-11-7-7использовалиферментационную среду, состав которой приведён в разделе 2.5; для P.

canescens87Oryzin-25 использовали ферментационную среду с соевой мукой (раздел 3.1.4.2).Колбы засевали споровой суспензией, условия культивирования описаны вразделе 2.5.По окончании ферментации отделение биомассы проводили с помощьюфильтров из нетканого материала, полученный фильтрат КЖ охлаждали при +4℃в течение 15–20 мин, затем смешивали с охлажденным при -20ºС ацетоном всоотношении 1:2 (фильтрат КЖ:ацетон) при интенсивном перемешивании иоставляли на 20–30 минут для формирования осадка. После этого верхний слойжидкости декантировали, а оставшуюся жидкость с осадком центрифугировали20 мин при 6000 об/мин. Полученный осадок высушивали до полученияпостоянной массы при комнатной температуре. В результате было получено 3ацетоноосажденных препарата: ПЕП, ПЕП-ЛАП и Оризин.

Путем смешиванияполученных ФП ПЕП и Оризин в соотношении 1:1 был получен мультиэнзимныйкомплекс(МЭК).ХарактеристикиполученныхацетоноосажденныхФПпредставлены в таблице 22.Таблица 22 – Характеристика ацетоноосажденных ферментных препаратовФПБелок,мг/гПС, ед./грН 4,7, 30℃гемоглобинрН 10,0, 40℃казеинатнатрияЛАПА,ед./грН 5,0, 30℃КсА, ед./грН 5,0, 50℃ПЕП-АПЕП-ЛАП-АОризин-АМЭК-А273±20280±14300±201512±761172±60-340±20125±6-728±551524±764000±250ПЕП-А+Оризин-А всоотношении 1:1277±20870±60170±10-3140±220Таким образом, с помощью осаждения ацетоном фильтрата КЖ штаммов P.canescens RN3-11-7-7, Pep-4 и Oryzin-25 наработанных в качалочных колбах, былиполучены лабораторные образцы сухих комплексных ФП: ПЕП, содержащийПЕП (1512 ед./г по гемоглобину) и Ксил (728 ед./г); ПЕП-ЛАП содержащий ПЕП(1172 ед./г по гемоглобину), ЛАП (125 ед./г) и Ксил (1524 ед./г); Оризин,содержащий щелочную сериновую протеазу (340 ед./г по казеинату натрия) иКсил (4000 ед./г).

Был также получен МЭК, ПЕП+Оризин, содержащий ПЕП (87088ед./г по гемоглобину), щелочную сериновую протеазу (169 ед./г по казеинатунатрия) и Ксил (3140 ед./г).3.3 Масштабирование процесса культивирования рекомбинантных штаммовв условиях промышленного производстваС целью внедрения в производство новых штаммов – продуцентов протеаз игемицеллюлаз и получения опытных промышленных партий комплексных ФП назаводеООО«Агрофермент»былипроведеныиспытаниятехнологиикультивирования рекомбинантных штаммов – P. canescens Pep-4 (продуцентПЕП) и P. canescens RN3-11-7-7 (продуцент ПЕП и ЛАП).В качестве посевного материала использовали штаммы, хранящиеся наагаризованной среде не более 6 месяцев.

ВПМ получали путем глубинногокультивирования в качалочных колбах. Инокулят выращивали в течение 25 ч винокуляторе с геометрическим объёмом 1 м3 и рабочим объёмом 0,5 м3 наферментационной среде, состав которой приведён в разделе 2.5, при температуре28–30℃ и интенсивности перемешивания 279 об/мин. Для засева инокуляционнойсреды использовали 5 дм3 ВПМ.Культивирование штаммов проводили на ферментационной среде, в составкоторой входили оболочки сои, кукурузный экстракт и монофосфат калия (см.ниже) в рабочих ферментерах объемом с геометрическим объёмом 10 м3,оснащенных барботерами для подачи воздуха и турбинной мешалкой, двигателькоторой позволяет развивать обороты до 199 об/мин.Для осуществления процесса культивирования штаммов использовалиаппаратурно-технологическую схему, которая предусматривала смешиваниекукурузного экстракта, КH2PO4, пеногасителя Лапрол с горячей водой (50–60℃) всмесителе при постоянном перемешивании; смешивание в отдельном реакторегранулированной соевой оболочки (молотой) с холодной водой при медленномперемешивании;передачуспомощьюроторно-пульсационногоаппаратаполученной суспензии в смеситель, в котором уже находятся остальные89компоненты питательной среды; подогрев общей смеси до 90℃ и инкубированиевтечение40минприпостоянномперемешивании;стерилизациюсиспользованием установки непрерывной стерилизации (УНС) под давлением итемпературе 140℃ с временем выдерживания 600 сек; охлаждение стерильнойпитательной среды до 40℃; передачу её в ферментер, охлаждение среды до 37℃ ивыдерживние в течение 4 ч при данной температуре (под давлением; мешалка с100% оборотами – 199 об/мин и 100% аэрацией – 420 м3/ч).Для осуществления ферментации в рабочих ферментерах объемом 10 м 3были определены следующие параметры: максимальная скорость перемешивания – 199 об/мин; коэффициент загрузки ферментеров – 0,6–0,65; режим расхода воздуха постоянный – 420 м3/ч; температура культивирования – 28–29℃; ферментационная среда – 4,5% оболочки сои гранулированной, 5%экстракта кукурузного сгущенного, 2,5% монофосфата калия, пеногасительЛапрол; рН – естественный; давление в ферментере в процессе роста – 0,04 мПа; продолжительность ферментации – ок.

Характеристики

Список файлов диссертации