Диссертация (1151601), страница 9
Текст из файла (страница 9)
В работеиспользованы перевиваемые клеточные линии пула печени и селезёнкисибирского осетра Acipenser baeri (SSO-2), селезёнки белого осетра (WSS-2)сыворотка плода коровы (СПК, gibko invitrogen), питательная среда 199,Диспеиргирующий раствор: раствор трипсина (0,25%) (ПИПВЭ РАН), растворверсена (0,02%), антибиотики: бензпенициллина натриевая соль, стрептомицинасульфат, гентамицин, нистатин.Для вирусологических исследований отбирали кусочки паренхиматозныхорганов: печени, почек, селезёнки, а также кожу, плавники, жабры и слизь.
Слизьотбирали на 20 сутки после заражения от всех рыб. Выделение вируса проводилисогласно методическим рекомендациям[11, 12]. Титр вируса рассчитывали пометоду Рида и Менча [3].В работе использовали следующее оборудование и принадлежности:Настольный бокс с вертикальным ( Belko Glass, Inc) и горизонтальным (АНС-4А1,ESCO) ламинарным потоком воздуха; инвертивный микроскоп Nikon Eclipse TS100, термостат ТС 1; хладотермостат ХТЗ/40-2 (+150 , +190С ); бытовойхолодильник (+40С); термостаты ТС-80; низкотемпературный холодильник (- 70);весы электронные аналитические (Ohaus); низкоскоростная рефрижераторнаяцентрифуга К – 70D; дозаторы с переменным объемом; 96-луночные пластиковыепланшеты; стеклянная лабораторная посуда общего назначения.44Для микроскопического выявления бактерий рода Flexibakter и грибов родаSaprolegnia готовили нативные мазки из соскоба кожи с последующей изокраской синькой Лефлера в разведении 1:10.3.1.5 Электронно-микроскопические исследованияЭлектронно-микроскопические исследования проводились совместно ссотрудниками Центра коллективного использования электронной микроскопииФГНУ Института биологии внутренних вод им.
И.Д. Папанина РАН пообщепринятым методикам [14]. Для выявления вирусных частиц и изучения ихморфологии применяли электронный микроскоп Jem 100C.3.1.6 Общее количество рыб, подвергнутых исследованиямКоличество рыб подвергнутых клиническим, патолого-морфологическим,вирусологическим,бактериологическимиэлектронно-микроскопическимисследованиям представлено в таблице 3.Таблица 3. Количество рыб, подвергнутых исследованиямВиды исследованийКоличество рыб ( экз.)Общее количество рыб200Клинические200Патолого-анатомические127Гистологические63Электронно-8микроскопическиеВирусологические67Бактериологические243.1.7 Статистические методыСтатистическую обработку данных проводили согласно общепринятымметодам [9].453.2 Результаты собственных исследованийЗаболевание воспроизведено во всех опытах, но тяжесть течения, динамикаразвития болезни и клинического проявления инфекции в разных экспериментахотличались.
Герпесвирус реизолировали из всех органов рыб, взятых дляисследований. При этом содержание вируса в органах во всех трёх биопробахбыло примерно в одинаковых пределах: в пробах кожи и плавников – 6 – 8 lgТЦД50/мг ткани; в печени, почках, кишечнике и сердце – 6 – 7 lg ТЦД50/мг ткани;жабрах – 5 – 6 lg ТЦД50/мг ткани; в мозге и селезёнке – 3 – 5 lg ТЦД50/мг ткани.3.2.1 Опыт 1. Результаты исследований при заражении сеголетковгибрида русского и сибирского осетров штаммом SK1/0406Клиническое течение инфекции. Длительность опыта составляла 50 суток.Первые клинические признаки заболевания отмечены у 1 рыбы на 21 сутки послезаражения.
Затем тяжесть болезни нарастала. На 23 сутки появились клиническиепризнаки у 2 экземпляров, на 27 - симптомы отмечены ещё у 1 рыбы и одна рыбапогибла. На 32 сутки явные клинические признаки наблюдались ещё у 3 рыб, двеиз которых погибли. К 38 суткам явные симптомы болезни, а также осложнениеболезни сапролегниозом наблюдались у 2 рыб, одна из них погибла. На 40 сутки удвух рыб были обнаружены покраснения в области жучек, анального и брюшныхплавников, которые через два дня исчезли.
На 42 сутки погибла ещё одна рыба свыраженными клиническими признаками. Эксперимент был завершён в связи сотсутствием симптомов заболевания у оставшихся рыб.Обобщённые данные по развитию болезни представлены в таблицах 4,5.46Таблица 4 – Развитие клинических признаков сеголетков гибрида русскогои сибирского осетров, заражённых штаммом SK1/0406.КоличестводнейсКлинические признаки и внешние изменениямоментазаражения21Вялость, апатия, отказ от корма, учащённое дыхание22-27Вертикальное положение, хаотичные движения, атрофиямышц, петехии, бляшки25-32Распад ткани кончиков плавников, геморрагии,32-42Выпадениепрямойкишки,адинамия,вторичнаяинфекция(сапролегниоз)Таблица 5 Кумулятивная гибель сеголетков гибрида русского и сибирскогоосетров, зараженных штаммом SK1/0406, (n=20)Количество дней смомента зараженияКумулятивнаягибель, экз/%Как210видно из таблиц271/5инкубационный3238423/154/205/25периодсоставил 21 день,заболеваемость – 35%, (7 рыб), смертность – 25% (5 рыб).В процессе опыта от больных вынужденно убитых рыб были взяты пробыдля вирусологических (5 экз.) гистологических (5 экз.) и электронномикроскопических исследований (8экз.).
Параллельно с этим такие же пробывзяты для вирусологических и гистологических исследований от рыб контрольнойгруппы (6 рыб).Результаты вирусологических исследований. Исходный вирус выделен внаиболее высоких титрах из проб кожи, слизи, печени, почек, спиральной кишки(5.8-7,1 lg ТЦД50/см3,), и несколько ниже из жабр, селезёнки и сердца (5.1-5.6 lgТЦД50/см3,). У двух рыб вирус был выделен только из слизи. У рыб контрольнойкрупы вирус не выделен.Результаты расчёта титра вируса представлены в таблице 647Таблица 6 – Содержание вируса в патматериале от больных рыб№РыбыXТитр вируса lg ТЦД50/см3ПлавникКожаЖабрыПеченьСелезёнкаПочкаСр. кишкаСердцеСлизь16.354.85-6.15.856.15.356.15.3525.857.16.16.35-6.15.853.856.3535.15.16.16.16.355.856.355.26.3546.356.14.355.355.355.15.355.14.3556.1-6.1-6.1-5.1-6.1-6.35-5.356.8565.35--4.357--------4.1x5.85.855.666.00±0.335.66±0.845.855.85±0.55.10±0.815.39±1.348Идентичность выделенного вируса подтверждена по ЦПД в культуре клетоки с помощью электронной микроскопии.
При инокуляции патологическимматериалом в клеточной линии SSO2 первые признаки ЦПЭ появлялись через 5дней. При этом наблюдалось округление клеток, и образование кластеров. Через10 дней отмечалась полная деструкция мнослоя.При электронно – микроскопических исследованиях в ядрах и в цитоплазмеэпителиальных клеток кожи выявлены капсиды по размеру (диаметр около 100нм.) и морфологии соответствующие герпесвирусу (рис. 3).абРис.3 а,б – Эпителиальная клетка эпидермиса кожи, инфицированнаяSbSHV. Стрелками обозначены капсиды вируса.Гидрохимические показатели качества воды на протяжении экспериментанаходились в оптимальных пределах (табл.
7).Таблица 7 – Гидрохимические показатели качества водыПоказателиКонцентрация,мг/лО2NH4+NO2-NO3-pHdhFe7-8˂0,3˂0,1˂0,57-86-7˂0,01Клинические признаки и патологоанатомические изменения. Послезаражения сеголетков штаммом SK1/0406 первые признаки болезни появились на21 сутки у одной рыбы. Они выражались замедлением движения, отказом откорма, истощением, атрофией мышц в области спины. Через два дня у этой рыбына жучках хвостового стебля появились точечные кровоизлияния, а такжебляшки на хвостовом плавнике (рис.4). На 26 сутки у неё были заметны признаки49некроза на дистальных концах хвостового, анального и брюшного плавников, а на27 сутки наступило агональное состояние (адинамия, плавание на спине или боку,рис.
14). В этот период провели её убой, вскрытие и отбор кусочков органов дляпатогистологических исследований. При аутопсии у неё отмечали в брюшнойполостинезначительноескоплениепрозрачногоэкссудата,точечныекровоизлияния на брюшине, желчный пузырь переполнен желчью, селезёнка неувеличена светло – розового цвета. Печень и почки бледные, печень рыхлойконсистенции (рис.13). Лимфоидная железа сердца увеличена, беловатого цвета.Желудок и двенадцатиперстная кишка без пищевых масс и видимых изменений,спиральный отдел средней кишки с признаками катарального воспаления,выражавшегося покраснением слизистой оболочки и скоплением студенистогоэкссудата.Ещё у 4 рыб на 25 сутки после заражения, наблюдали те же симптомыболезни: угнетение, отказ от корма, покраснение на брюшных, грудных ианальном плавниках. На 27 сутки ещё у 1 рыбы на концах хвостового плавникабыли видны полупрозрачные бляшки размером 1-3 мм, на других плавниках ичастях тела подобных образований не выявлено.
Одна рыба принималаположение вверх головой в виде «свечи» (рис.5), у всех заболевших особейобнаруживали геморрагии в области жучек (рис.6), изъязвления их вершин(рис.8), покраснения и точечные кровоизлияния на коже в вентральной части тела(рис.7). У двух рыб на спинках и боках под кожей выявлялись признакизастойной гиперемии, в виде повышенной инъекции сосудов (рис.9). У 3-х рыб,погибших на 28-32 сутки, наблюдали гиперемию слизистой, выпадение прямойкишки (проктит) (рис.10), точечные и пятнистые кровоизлияния в областибрюшка, хвостового стебля, анального и брюшного плавников, изъязвлениежучек. При вскрытии кишечник у них был свободен от пищевых масс, вспиральной кишке отмечено скопление слизеподобного содержимого с примесьюкрови. Печень бледная рыхлой консистенции, селезёнка с бледными пятнами(рис.11) В сердце увеличена лимфоидная железа (рис.12).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
