Диссертация (1151526), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Процедурыпреципитации и очистки ДНК выполняли так же, как и при выделении ДНК. Поокончаниипроцедур,деионизированнойводы,кполученномусмесьосадкуперемешивалииспользовали для рестрикции.57идобавлялиполученный15мклрастворДля проведения рестрикции в каждую пробирку к 100-400 нг. меченойДНК добавляли реагенты (Fermentas, США): 1,5 мкл буфера для рестрикции; 10ед.
рестриктазы (HaeIII, HhaI и MspI); деионизированной воды – до 15 мкл.Далее смесь перемешивалась в вортексе (CVP-2, BioSan, Латвия) ицентрифугировалась в течение 1 мин при 4000 об/мин. Затем полученную смесьставили в термостат и по истечении срока инкубирования (определенногофирмой-изготовителем), смесь прогревали при 720С – 20 мин.Следующим этапом подготовки был капиллярный электрофорез. Дляэтого полученную смесь ДНК с рестриктазой вносили в пробирку эппендорф,добавляли 1 мкл гликогена, 1,5 мкл 3М раствора ацетата натрия и 40 мкл 96%спирта.
Полученную смесь в течение 2 мин смешивали в вортексе (CVP-2,BioSan, Латвия), затем центрифугировали 10 мин при 14000 об/мин, удалялижидкую фазу, а осадок инкубировали в термостате «Гном» (Россия) притемпературе 450С до полного высушивания. Затем полученный осадокрастворяли в 10 мкл буфера для разделения SLS (Bechman Coulter).
К каждойпробе ДНК добавляли 0,2 мкл контрольного маркера – набора для определенияразмера фрагментов ДНК – 600 («Size Standart 600», Beckman Coulter).Полученную смесь перемешивали в вортексе (CVP-2, BioSan, Латвия)втечение 1-2 мин, добавляли по 10 мкл минерального масла. Затем пробыпомещали в автоматический секвенатор CEQ8000 (Bechman Coulter, США),снабженныйпрограммойподсчетадлиныфрагментовкаждойпробыотносительно заложенных в пробу стандартов. Введение в каждую пробуконтрольного маркера («Size Standart 600», Beckman Coulter) позволилопровести точное определение длины рестрикционных фрагментов.После проведения электрофореза его параметры хранятся в файлах,содержащих табулированные данные сканирования геля и его графическийимидж – электрофореграмму (рис.
3).58Рис. 3. Электрофореграмма бактериального сообщества содержимогокишечника бройлеров: пики красного цвета – маркерные, синего цвета –искомые.На первом этапе после получения данных T-RFLP производится проверкакачества полученных T-RFLP- грамм. Интенсивность флуоресценции должнасоставлять 10-200 тыс. единиц, длина контрольных фрагментов – 600 п.н. Затемпроводился подсчет матрицы данных при помощи таблицы Exel. После этогопроводилосьопределениефилогенетическойпринадлежностимикроорганизмов с помощью программы FragSort (http://mica.ibest.uidaho.edu).Эта программа формировала сводную таблицу, в которой каждому пикуприсуждалось несколько возможных кандидатур микроорганизмов, имеющихсоответствующие длины терминальных рестрикционных фрагментов гена16SрРНК.Дляопределенияточнойтаксономическойпринадлежностифилотипов, использовались результаты обработки проб как минимум для трехэндонуклеаз (HaeIII, HhaI и MspI).
Содержание филотипов микроорганизмовопределяли при расчете процентной доли в микробном сообществе.Далее для определения количественного содержания в пробе конкретнойгруппы микроорганизмов, основываясь на данных T-RFLP-анализа, проводилиисследования методом Real-Time PCR (RT-PCR). Выделение ДНК дляпроведения RT-PCR и контроль качества препарата проводились аналогичнотаковым для T-RFLP.59Для проведения ПЦР-амплификации ДНК готовили смесь реагентов(Fermentas, США): праймеры – 10 пМ; Taq-полимераза – 10 единиц; х10 буфердля Taq-полимеразы; MgCl2 – 2,5 мМ; смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов –до концентрации 2,5 мМ; ДНК - матрица – 10 нг.
Для амплификации гена 16Sбактерий подбирали специфичные варианты олигонуклеотидов, меченных с 5’конца флуоресцентной меткой. Дополнительно к опытным пробам включалинегативный контроль (смесь без ДНК) и 4 позитивных контроля (ДНКопределяемого микроорганизма в серии разведений концентраций геномов).ПроцедуруПЦР-амплификациипроводиливавтоматическомпрограммируемом амплификаторе iCycler (Bio-Rad, США) в следующемрежиме: 1 шаг (прогрев): 95°С – 3 мин; 2 шаг (денатурация, отжиг праймеров,элонгация): (95°С – 30 с, 58-60°С – 30-60 с, 72°С – 1 мин) – 34 раза; 3 шаг: 72°С(элонгация) – 10 мин. В режиме реального времени программа амплификаторана основании стандартов с известной концентрацией геномов строилакалибровочный график, согласно которому вычислялось количество геномов вопытных пробах.
Математическая обработка результатов проводилась сиспользованием программы Exel.602.3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ2.3.1.МикрофлораЖКТ,физиологическиеизоотехническиепоказатели цыплят-бройлеров при использовании в рационе кормовживотного происхождения в течение всего периода выращивания на фонеприменения препаратов Стафак-110 и Целлобактерин-Т2.3.1.1. Данные T-RFLP– анализа микрофлоры двенадцатиперстнойкишки и слепых отростков цыплят-бройлеровРезультаты анализа общего количества бактерий в исследованных пробахпоказали, что в обеих опытных группах (с введением в рацион антибиотика ипробиотика) количество бактерий было более высоким по сравнению сконтрольной группой (Таблица 7).Таблица 7.Общее количество бактерий в ЖКТ бройлеровГруппаКоличество микроорганизмов, геномов/гОтделкишечникав возрасте бройлеров, дней17142136КонтрольнаяДвенадцатип.9,6*1071,1*1082,1*1081,5*1092,2*109группаСлепой7,0*1091,6*10102,4*1092,6*10106,3*1010Двенадцатип.1,9*1096,4*1091,3*1091,5*1097,1*109Слепой2,5*10101,4*10112,2*10103,1*10108,3*1010Двенадцатип.4,0*1092,6*1081,5*1092,3*1097,0*1010Слепой1,4*10101,2*10111,3*10112,8*10108,3*1010АнтибиотикПробиотикТак, через сутки после кормления, в содержимом двенадцатиперстнойкишки цыплят в опытной группы с введением в рацион пробиотика общееколичество бактерий было выше в 41,66 раз, а у цыплят опытной группы скормовым антибиотиком – в 19,79раз относительно контрольной группы.Общая численность бактерий в содержимом слепой кишки в опытной группе свведением в рацион антибиотика была выше в 3,57 раза, а в опытной группе с61пробиотиком – в 2,0 раза по сравнению с контролем.
Полученные результатысвидетельствуют о более быстром заселении желудочно-кишечного трактацыплят опытных групп микрофлорой, что важно для развития кишечника.В 7 - дневном возрасте у цыплят опытной группы с введением в рационантибиотика общее количество бактерий в содержимом двенадцатиперстнойкишки было выше в 58,18 раз, а у цыплят опытной группы с введением врацион пробиотика – в 2,36 раза относительно контрольной группы. Общееколичество бактерий в содержимом слепых отростков у цыплят опытнойгруппы с кормовым антибиотиком было выше в 8,75 раза, а у цыплят опытнойгруппы с пробиотиком – в 7,5 раз по сравнению с контролем.У 14-дневных цыплят в содержимом двенадцатиперстной кишки опытнойгруппы с введением в рацион пробиотика общее количество бактерий быловыше в 7,14 раза, а у цыплят опытной группы с кормовым антибиотиком – в6,19 раза относительно контрольной группы.
Общее количество бактерий всодержимом слепых отростков цыплят опытной группы с введением в рационпробиотика было выше в 54,16 раза, а у цыплят опытной группы с кормовымантибиотиком – в 9,16 раза по сравнению с контролем.В 21-дневном возрасте в содержимом двенадцатиперстной кишки уцыплят опытной группы с пробиотиком общее количество бактерий было в 1,53раза выше контрольной группы, а в опытной группе с введением в рационантибиотика – на уровне контроля.
Обще количество бактерий в содержимомслепых отростков в опытной группе с кормовым антибиотиком было выше в1,19 раза и в опытной группе с введением в рацион пробиотика – в 1,07 разаотносительно контрольной группы.В 36 - дневном возрастеобщее количество бактерий в содержимомдвенадцатиперстной кишки у цыплят опытной группы с введением в рационпробиотика было выше в 31,81 раза, а у цыплят опытной группы с кормовымантибиотиком – в 3,22 раза относительно контрольной группы.
Общее62количество бактерий в содержимом слепых отростков цыплят обеих опытныхгрупп было в 1,32 раза выше контрольной группы.Среди представителей нормоценоза кишечника значительную рольиграютбактериисцеллюлозолитическойактивностью:бактероиды,лахноспиры, руминококки, термоанаэробактерии, сукцинивибро, клостридии.Поскольку у птиц практически отсутствуют собственные пищеварительныеферменты для расщепления целлюлоз и других некрахмалистых полисахаридовроль данных микроорганизмов в пищеварении цыплят-бройлеров труднопереоценить.
Количество целлюлозолитических бактерий представлено втаблице 8.Таблица 8.Количество целлюлозолитических бактерий в ЖКТ бройлеровГруппаКонтрольная группаАнтибиотикПробиотикОтделкишечникаКоличество микроорганизмов, геномов/гв возрасте бройлеров, дней17142136Двенадцатип.9,2*1061,3*1083,2*1065,9*1074,3*107Слепой2,3*1096,1*1085,0*1086,7*1088,6*108Двенадцатип.8,0*1071,2*1093,9*1062,9*1084,7*107Слепой4,6*1092,2*10106,9*1092,2*1093,1*109Двенадцатип.1,3*1084,9*1093,4*1071,6*1093,6*108Слепой7,7*1092,7*10101,3*10106,1*1094,4*109Уже у суточных цыплят количество целлюлозолитической микрофлоры вЖКТ было выше в опытных группах с введением в рацион антибиотика ипробиотика по сравнению с контрольной группой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
