Диссертация (1151526), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Все показатели учитывались в соответствии с «Методическимруководством по оценке качества кормов, органов, тканей, яиц и мяса птицы»(ВНИТИП, 2010):51– первоначальную влагу определяли высушиванием в сушильном шкафу притемпературе 65º C до воздушно-сухого состояния;– гигроскопическую влагу определяли при температуре 100-105ºC допостоянного веса (ГОСТ Р 52838-2007);– общий азот – методом Кьельдаля (ГОСТ Р 51417-99); содержание сырогопротеина – путем умножения процентного содержания азота на коэффициент6,25;– сырой жир – экстрагированием серным эфиром в аппарате Сокслета (ГОСТ13496.15-97);– сырую клетчатку – кипячением в слабых растворах кислот и щелочей пометоду Геннеберга и Штомана (ГОСТ Р 52839-2007);–кальций–трилонометрическисиспользованиемспектрофотометраAASPECTRAA «Duo 240FS/240Z» (ГОСТ 26570-95; ГОСТ 28901-91);–фосфор–фотометрическимметодомсиспользованиемфотоэлектроколориметра КФК- 2 (ГОСТ 26657-97; ГОСТ Р 51420-99).Математическую и статистическую обработки результатов проводили сиспользованием программного обеспечения EXCEL XP/200, включающейподсчет средней величины (М), ошибки средней арифметической (m),дисперсионного анализа, коэффициента корреляции (r).2.2.2.МетодикаT-RFLP- анализа микрофлоры желудочно-кишечного тракта птицыПоявление и развитие современных молекулярно-генетических методовпозволилоизучатьразнообразиемикроорганизмовбезограничений,сопутствующих традиционным техникам, т.е.
минуя стадию культивирования.К наиболее перспективным приемам в настоящее время относят применениеполимеразной цепной реакции, и в частности T-RFLP-анализ (Terminal52restriction fragment length polymorphism) — молекулярно-генетический метод,основанныйнаоценкеполиморфизмадлинамплифицированныхрестрикционных фрагментов ДНК микроорганизмов.
Он предназначен дляопределения общей и относительной численности, а также таксономическойпринадлежности всех бактерий в микробной экосистеме, что дает возможностьосуществлятьширокомасштабноеидетальноесравнительноеизучениемикробных сообществ в их развитии и изменении (Xiang et al., 2002; AmitRomach et al., 2004).Одним из наиболее перспективных на сегодняшний день является TRFLP – анализ (Terminal restriction fragment length polymorphism) – молекулярно–генетическийметод,амплифицированныхмикроорганизмов.основанныйнарестрикционныхОнпредназначенанализеполиморфизмафрагментовдлягенаопределения16SдлинрРНКколичества,относительной численности и таксонометрической принадлежности всехбактерий микробной экосистемы.
Это дает возможность широкого и глубокогоизучения микробиологических сообществ в их развитии и изменении (Лаптев,2012). В России метод T-RFLP в связи с высокой стоимостью оборудованиядля анализа, а также отсутствием квалифицированных кадров, используется восновном лишь для анализа почвы и кала человека.В связи с этим сотрудниками лаборатории молекулярно-генетическихисследований ООО «Биотроф» в 2008 году впервые в России на основе анализазарубежных исследований (Torok et al., 2008) и отечественных данных(Брюханов и др., 2012) методика T-RFLP была модифицирована для изучениямикрофлорыжелудочно-кишечногоОтечественнымиисследователямитрактасельскохозяйственныхсовместнопроведена апробация метода (Лаптев, 2010;сООО«Биотроф»птиц.былаМанукян и др., 2013).Предложенный регламент позволяет за короткий срок максимально точноопределять состав микрофлоры пищеварительного тракта, на ранних стадиях53выявлять патогенные формы, а также оценивать эффект кормовых добавок вотношении микрофлоры кишечника.T-RFLP – анализ микрофлоры кишечника птицы включает следующиестадии (рис.
1):1. Выделение общей (тотальной) ДНК микроорганизмов;2. ПЦР – амплификацию фрагментов генов бактерий (16S рДНК) сфлуоресцентно-мечеными праймерами (обычно с 5’-конца);3. Ферментативную обработку амплификата с помощью эндонуклеазрестрикции(обычноиспользуютэндонуклеазы,узнающиепоследовательности из 4 нуклеотидов);4. Разделение полученных в результате рестрикции фрагментов ДНК вполиакриламидном геле в секвенаторе вместе с флуоресцентно меченымДНК-маркером известного размера.Секвенаторснабженкомпьютернойпрограммойавтоматическогоподсчета длин фрагментов, основанной на определении электрофоретическойподвижности фрагментов каждой пробы относительно заложенных в пробустандартов длины.Каждый пик T-RFLP – анализа отражает вид микроорганизма, аинтенсивность флюоресценции пика – его процентное содержание в микробномсообществе.Определениефилогенетическойпринадлежностимикроорганизмов проводилось с помощью программ и баз данных Arlequin,FragSort, TRAMPR и T-REX.Дополнить и расширить результаты T-RFLP- анализа позволяет RTPCR- анализ – молекулярно-генетический метод, основанный на полимеразнойцепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени.Применение данного метода дает возможность провести количественноеопределение доли микроорганизмов в сообществе.54Рис.
1. Стадии выполнения T-RFLP – анализа.Выделение ДНК для проведения T-RFLP - анализа проводилось припомощи набора «Genomic DNA Purification Kit» (Ferments, Литва) и включало всебя процедуры лизиса, преципитации (осаждения ДНК). Для лизиса клеточныхстенок в пробирку типа эппендорф объемом 1,5 мл к навеске 200 мкг добавляли400 мкл лизирующего раствора (lisys solution) и перемешивали полученнуюсмесь в вортексе (CVP-2, BioSan, Латвия) и инкубировали в термошейкере (TS100, Biosan, Латвия) при 65ОСв течение 30 минут. Преципитация ДНКпроводилась в микроцентрифужных пробирках с добавлением 800 мклспециального раствора (precipitation solution), после чего смесь помещали вмультивортекс (V-32, Biosan, Латвия) а затем центрифугировали в настольнойцентрифуге (Beckman Coulter, США) при 14000 оборотах в течение 10 минут.После центрифугирования надосадочную жидкость сливали, а осадок заливали100 мкл раствора хлорида натрия (NaCl solution) и 300 мкл 96% этиловогоспирта и тщательно перемешивали в вортексе (CVP-2, BioSan, Латвия).
Затемсмесь центрифугировали (Beckman Coulter, США) при 14000 оборотах втечение 10 минут, после чего надосадочную жидкость сливали, а осадокинкубироваливтермостате«Гном»55(Россия)при45ОСдополноговысушивания. К осадку добавляли 100 мкл стерильной дистиллированной водыи перемешивали смесь в вортексе (CVP-2, BioSan, Латвия). Полученныйраствор ДНК хранили в морозильной камере при -20оС до дальнейшихисследований.Качество препарата ДНК оценивали с использованием электрофореза вагарозном геле (рис. 2).
Для проведения электрофореза готовили 1%-ыйагарозный гель, в котором формировали лунки. Готовый гель помещали вкамеру для электрофореза (Bio-Rad, США), залитую буферным раствором ТАЕ(Gene Ruler, Fermentas, США). Затем вносили в каждую пробу ДНК (20 мкл) по2 мкл буферного раствора и полученную смесь вносили в лунки геля.
В крайниелунки вносили стандартный маркер (Gene Ruler, Fermentas, США) по 3 мкл.Затем камеру для электрофореза закрывали, подключали электроды ивыставляли напряжение 50В и оставляли на 1 час. После электрофореза гельизвлекали и помещали в трансиллюминатор (New England BioGroup, США), гдепри ультрафиолетовом излучении при длине волны 260 нм анализировали идокументировали размеры фрагментов ДНК и ее чистоту (должна быть малофрагментирована).Полимеразная цепная реакция представляет собой процесс многократногоувеличениячислакопий(амплификация)фрагментаДНК-мишени,катализируемый in vitro термостабильной ДНК-полимеразой, и позволяетобнаружить специфичный участок генома микроорганизма.
Для проведенияПЦР-амплификации ДНК готовили смесь реагентов (Fermentas, США):праймеры– 10 пМ;Taq-полимераза – 10 единиц; х10 буфер для Taq-полимеразы; MgCl2 – 2,5 мМ;смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов – доконцентрации 2,5 мМ; ДНК - матрица – 10 нг. Для амплификации гена 16Sбактерий подбирали специфичные варианты олигонуклеотидов (63f, 1087r),меченных с 5’ конца флуоресцентной меткой.
Дополнительно к опытнымпробам включали негативный (смесь без ДНК) и позитивный контроль (ДНК,успешно прошедшая ПЦР в предыдущих экспериментах). ПЦР-амплификацию56проводили в програмируемом амплификаторе iCycler (Bio-Rad, США). Режимыамплификации были следующие: 1 шаг (прогрев): 95°С – 3 мин;2 шаг(денатурация, отжиг праймеров, элонгация): (95°С – 30 с, 42-60°С – 30-60 с,72°С – 1 мин) – 34 раза; 3 шаг (элонгация): 72°С – 10 мин. Качество препаратаоценивалось с использованием электрофореза (Bio-Rad, США), как былоописано выше с учетом размера фрагментов и чистоты ДНК.Рис. 2. Электрофорез в агарозном геле: М - используемый маркер, А-Е–исследуемые пробы препарата ДНК.После разделения фрагментов ДНК посредством электрофореза, припомощи острого скальпеля в геле вырезали полосу с необходимым фрагментомДНК, после чего ее переносили в микроцентрифужную пробирку.
ОчисткуДНК из полосы агарозного геля проводили с использованием набора «GenomicDNA Purification Kit» (Fermentas, Литва). В микроцентрифужную пробирку сгелем добавляли 400 мкл лизирующего раствора (lysis solution), перемешивалив вортексе (CVP-2, BioSan, Латвия) и инкубировали при 650С в течение 5 мин втермостате «Гном» (Россия) до полного растворения агарозы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
