Диссертация (1151313), страница 18
Текст из файла (страница 18)
ед.± 0.3± 0.3± 0.2± 0.3± 0.2± 0.4 ± 0.2Таблица 6. Изменение эмиссионной активности A. fischeri в зависимости от частоты модуляцииУЗ при интенсивности 0.4 Вт/см2 (M ± m)ν, ГцКонтроль 5.0 ± 0.2 7 ± 0.2 9 ± 0.2 10 ± 0.2 12 ± 0.2 14 ± 0.2Интенсивность свечения,20.83.712.519.928.227.218.8отн. ед.± 0.3± 0.2± 0.2± 0.3± 0.4± 0.4± 0.2Установлено, что направленное воздействие УЗ интенсивностью 0.2 Вт/см2 и частотоймодуляции менее 85 Гц практически мало отражается на степени эмиссии клеток культуры, тогдакак при частоте модуляции УЗ 120 Гц биолюминесценция полностью подавляется.
В диапазонечастот модуляции УЗ от 85 до 100 Гц при указанной интенсивности 0.2 Вт/см2 воздействие УЗувеличивает степень эмиссии.Оптимальным при воздействии модулированного УЗ было найдено 3–5-минутноевоздействие для 10–15 мл.УЗ интенсивностью 0.4 Вт/см2 и частотой модуляции 9 и 14 Гц не оказываютзначительного воздействия на изменение степени свечения бактериальных клеток. Но при болеенизких частотах модуляции, 5–7 Гц, интенсивность свечения падала в 2–5 раз. Стимуляциюлюминесценции наблюдали лишь при частотах модуляции 10–12 Гц.§ 6.3.
Действие модулированного ультразвука на рост культурыHalobacterium halobiumКлетки опытной культуры археи H. halobium инсонировали УЗ различной интенсивностии частоты модуляции. Установлено, что при более высоком значении интенсивности УЗ, равном0.4 Вт/см2, лишь низкие частоты модуляции УЗ, от 0.25 до 0.7 Гц, способны стимулировать рост72археи (рисунок 14). Остальные опытные частоты модуляции УЗ оказывали слабое воздействиена рост культуры.Воздействие УЗ с более высокими величинами частот модуляции, от 10 до 100 Гц(таблица 7), в основном вызывало понижение оптической плотности клеточной суспензии архей,достигая уровня контрольных значений лишь в узком диапазоне 75–80 Гц.Таблица 7.
Зависимость оптической плотности культуры архей от частотымодуляции УЗ при интенсивности 0.4 Вт/см2ν, Гц0.10.20.250.30.50.7Оптическая плотность, отн. ед.D, отн. ед.; ± 0.00111.0125(контроль)1.03501.05001.06021.10051.18751.1250ν, Гц10–2535–4555–6575–8085–90100D, отн. ед.; ± 0.00151.0475(контроль)1.04501.05001.04521.05051.03111.02151.41.210.80.60.40.20123456Время, сутОпытКонтрольРисунок 14.
Рост контрольной и опытной популяции H. halobium после воздействия модулированным УЗинтенсивностью 0.4 Вт/см2 с частотой модуляции 0.5 Гц.Установлена существенная стимуляция роста и интенсивности свечения клеток A. fischeriобработкой как непрерывным УЗ с интенсивностью 0.4–0.6 Вт/см2, так и модулированным счастотой модуляции 10–12 Гц при интенсивности 0.4 Вт/см2 и 85–100 Гц при интенсивности0.2 Вт/см2.
Повышение частоты до 120 Гц приводило к разрушению клеточной стенки и гибелимикроорганизмов.УЗ интенсивностью 0.4 Вт/см2 оказывал стимулирующее воздействие на ростовыепроцессы архей на низких частотах модуляции 0.25–0.7 Гц. С увеличением частоты модуляцииот 10 до 65 Гц и от 85 до 100 Гц активная плотность культуры понижалась, оставаясь на уровнеконтроля вблизи частот 75–80 Гц. Воздействие с более высокими величинами частот модуляции(выше 100 Гц) также подавляло рост культуры.73747. Действие ультразвука на безъядерные клетки кровиживотных in vitro§ 7.1.
Особенности воздействия ультразвука на тромбоцитыНесмотря на распространение в последнее время в лабораториях счётчиков форменныхэлементов крови, наиболее часто подсчёт тромбоцитов осуществляется в окрашенных мазкахкрови, приготовленных с использованием краски Романовского [121]. Необходимо отметить, чтодля дифференциального подсчёта тромбоцитов используют концентрацию краски вдвое больше,чем для окраски мазка при подсчёте лейкоцитарной формулы. Метод основан на подсчётеколичества тромбоцитов на 1000 эритроцитов, с последующим пересчётом на 1 мкл крови,исходя из количества эритроцитов в этом объёме.
В норме число тромбоцитов — 200–400 × 109/л[там же]. Во всех известных методах окраски тромбоциты отдельно окрашивают крайне редко,поскольку в таком случае остальные форменные элементы учитывать невозможно или крайнезатруднительно. Одномоментной окраски форменных элементов, включая тромбоциты, бездополнительных затрат красителей в известных способах не происходит.Воздействие непрерывного ультразвукаНами была отработана методика одновременной глубокой окраски всех форменныхэлементов крови животного любого вида для изучения морфологии и диагностики измененийклеточных мембран и выявления морфологических особенностей кровяных пластинок.Найденный диапазон интенсивности УЗ и времени озвучивания обеспечивает гарантированнокачественную окраску тромбоцитов во всех случаях (независимо от особенностей конкретныхклеток, условий взятия и хранения крови, состояния животного, наличия патологическогопроцесса), не влияя отрицательно на окраску других форменных элементов.Образцы крови in vitro обрабатывали ультразвуком от 30 с до 45 с, интенсивностью 0.2–0.4 Вт/см2, частотой 0.88 МГц, бегущей УЗ волной, режим воздействия непрерывный.
Нарисунке 15 даны фотографии тромбоцитов после 30 и 35 с воздействия непрерывным УЗодинаковой интенсивности 0.4 Вт/см2 на кровь кошки и собаки. Видны чётко прокрашенныетромбоциты.75Рисунок 15а. Интенсивность 0.2 Вт/см2, время 30 с,воздействие непрерывное (кровь кошки)15б. Интенсивность 0.2 Вт/см2, время 25 с,воздействие непрерывное (кровь собаки).Использование быстрого дифференциального окрашивания (ДИФФ-КВИК) последействия УЗ позволило хорошо визуализировать тромбоциты и может быть использованов качестве модификации для подсчёта именно тромбоцитов любого размера и вида и дляодновременного изучения морфологических и цитологических особенностей всех окрашенныхклеток. Установлено, что наличие клеточных деформаций, анизоцитоза, повреждений ЦПМтромбоцитов не влияет на возможность визуализировать границы тромбоцитов.Результаты экспериментов также показали деструктивное влияния на кровяные пластинкинепрерывного УЗ низких интенсивностей.
С ростом времени облучения мы наблюдаликлеточную агрегацию, увеличение размеров тромбоцитов и их лизис (проиллюстрировано настраницах 94, 97 и 99: рисунки 21в, 23б и 24г).Воздействие импульсного и модулированного ультразвукаВ зависимости от интенсивности УЗ применяли разную экспозицию образцов крови: приинтенсивности 0.05 Вт/см2 обрабатывали в течение 30–40 с, при интенсивности 0.2 Вт/см2 —в течение 20–35 с, при интенсивности 0.4 Вт/см2 — в течение 15–30 с, при интенсивности0.7 Вт/см2 в течение 15–20 с.
Одновременно накладывали на указанные режимы любое значениеиз нижеперечисленных диапазонов частот модуляции: 10–30 Гц или 800 Гц, несущая частота0.88 МГц. Того же результата можно достичь без модуляции, используя частоту генерации2.64 МГц, интенсивность 0.4 Вт/см2, время воздействия 15–30 с в импульсном режиме(скважность 2). Применение модулированных воздействий снижает среднюю по пространствуи времени интенсивность в 2 раза, уменьшая риск повреждения клеток. После УЗ обработкиделали мазки крови и окрашивали по методу быстрого дифференциального окрашиваниябиопрепаратов ДИФФ-КВИК.Способокраскипредварительнуютромбоцитовобработкуобразцовпослекровивоздействияin vitroультразвукоммодулированнымвключает:ультразвуком,76интенсивностью 0.05 Вт/см2 в течение 30–40 с, или интенсивностью 0.2 Вт/см2 в течение 20–35 с,или 0.4 Вт/см2 в течение 15–30 с, или 0.7 Вт/см2 в течение 15–20 с с любой частотой модуляциив диапазоне частот модуляции от 10 до 30 Гц или с частотой модуляции 800 Гц и несущейчастотой 0.88 МГц, а также УЗ с несущей частотой 2.64 МГц, интенсивностью 0.4 Вт/см2в течение 15–30 с в импульсном режиме со скважностью 2 с последующим приготовлениеммазков крови и их окраской дифференциальными красителями.Результаты воздействия модулированного УЗ на кровь МДЖ представлены на рисунке 16.Отчётливо видны прокрашенные тромбоциты.а.
Режим обработки: 0.05 Вт/см2, 14 Гц,б. Режим обработки: 0.7 Вт/см2, в. Режим обработки: 0.4 Вт/см2,30 с10 Гц, 15 с.10 Гц, 30 с.Рисунок 16. Фотографии мазков крови кошки (а) и собак (б, в) с окрашенными тромбоцитами.С применением УЗ была отработана методика одновременной глубокой окраски всехформенных элементов крови, в то время как в известных способах окраски при окраскелейкоцитов невозможно всегда равномерно окрасить тромбоциты животного любого вида дляизучения морфологии и диагностики изменений клеточных мембран. Найденный диапазонинтенсивности, частот модуляции и времени гарантированно обеспечивает качественнуюокраску тромбоцитов во всех случаях (независимо от особенностей конкретных клеток, условийвзятия и хранения крови, состояния животного, наличия патологического процесса), не влияяотрицательно на окраску других форменных элементов.
У всех окрашенных клеток отчётливовидны: форма, размер, морфологические и цитологические особенности, целостность илиразрушение цитоплазматической мембраны (при наличии), ядра, зернистость цитоплазмы(у гранулоцитов),анизоцитозиликлеточныедеформации.Используемыепараметрыультразвукового воздействия являются терапевтическими и безопасными для экспериментатора.Разработанный способ был утверждён Федеральной службой по интеллектуальнойсобственности РФ в патентах RU 2589679 и RU 2589680.
Техническим результатом изобретенийявляется дифференциальная окраска всех форменных элементов крови, включая тромбоциты,после УЗ воздействия на образцы крови непосредственно до приготовления мазков, с одинаково77равномерной, глубокой и быстрой окраской всех клеток крови одним стандартным наборомкрасителей, без дополнительных средств (красителей, спиртов) и минимальной затратой времени(15–40 с). При реализации изобретения могут быть использованы любые из отечественныхи импортных ультразвуковых терапевтических генераторов с излучателями, работающих нанесущих частотах 0.88 и 2.64 МГц.§ 7.2.
Особенности воздействия ультразвука на эритроцитыДействие на эритроциты вызывало вначале изменение формы без внешних признаковразрушения или цитолиза, затем формирование групп вокруг клеток и цепочек. Было возможнопоявление теней клеток (рисунок 17е). Примеры большинства возможных изменений показанына рисунке 17.а)г)б)д)в)е)Рисунок 17. Фото мазков крови кошки, эритроциты.а) 0.7 Вт/см2, модуляция 10 Гц, 45 с. 1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
