Диссертация (1151313), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Супрессию базовой активности микроорганизмов наблюдали при рН < 6.5 и > 8.0(таблица 2, рисунок 10), также интенсивность свечения была значительно ниже в областитемператур роста менее 10°C и более 37°C. Вероятно, в таких условиях происходит разобщениесистемы переноса электронов на люциферазу, снижается скорость восстановления NAD+ NAD+зависимыми дегидрогеназами [299].Таблица 2. pH-зависимость свечения клеток A. fischeri в 0.1 M натрий-фосфатнокарбонатном буфере с 3% NaCl при 20°CI, % от контроля,I, % от контроля,I, % от контроля,pHpHpHточность ± 2%точность ± 2%точность ± 2%506.5608485.5107998.5186407.51029067Интенсивность свечения,% от контроля12010080604020055.566.577.588.59pHРисунок 10.
pH-зависимость свечения клеток A. fischeri в 0.1 M натрий-фосфатно-карбонатном буфере с 3% NaClпри 20°C.Воздействие факторов различной этиологии на клеткиВоздействие белков и пероксида водородаПри изучении воздействия разных концентраций белков — полученного с помощьюмодулированного УЗ лейкинферона и сывороточного альбумина — на характер изменениябактериального свечения наблюдали двухфазное изменение биолюминесценции с максимумомпри концентрации белка 20–35%.
При увеличении времени контакта клеток бактерий с белкамиболее 20–30 мин белки в указанных концентрациях начинали подавлять свечение. Изменениеуровня люминесценции при этом характеризовалось «колоколообразной» кривой. Приувеличении концентрации белка также наблюдали дозозависимое тушение люминесценции.Изменение температурного режима, от 5 до 37°C, продемонстрировало стимуляцию эмиссии при25–27°C. Таким образом, люминесцентная система A. fischeri выступала как системаиндикаторная и репортерная.Путём добавления пероксида водорода было установлено, что разведение H2O2в инкубационной среде до концентрации 0.00003% значительно стимулировало свечение безувеличения скорости роста (рисунок 11). Увеличение концентрации до 0.01% полностьюподавляло биохемилюминесценцию. Изучение другими исследователями особенностей свеченияморских фотобактерий в природной среде [89] показало, что наряду с кислородом в эмиссионнойреакции может участвовать и H2O2.
Целентеразин, природный люциферин большинствалюминесцирующих организмов, обладает мощными антиоксидантными свойствами. Увеличениесодержания пероксида водорода в опытах вызывало гибель несветящихся микроорганизмов,тогда как фотобактерии сохраняли жизнеспособность за счёт излучательной детоксикации [89].Интенсивность свечения, отн. ед.6830252015Опыт10Контроль500.000030.00030.0030.01Концентрация H2O2, %Рисунок 11.
Подавление интенсивности люминесценции A. fischeri при различной концентрации пероксидаводорода.Ультразвуковое воздействиеВ ходе проведённых экспериментов было показано, что УЗ низких интенсивностей 0.05–0.1 Вт/см2 при времени экспозиции, равном 1–3 мин, практически не влиял на последующий рости развитиебактериальнойкультуры,нопонижалинтенсивностьлюминесценцииинсонированных клеток, вероятно, не достигших состояния quorum–sensing.
Однако,интенсивность свечения быстро восстанавливалась после прекращения действия ультразвука.При увеличении интенсивности УЗ от 0.1 до 0.2 Вт/см2 свечение клеток резко возрасталои постепенно достигало контрольного значения. Воздействие ультразвуком интенсивностью0.4 Вт/см2 оказывало стимулирующее влияние на биолюминесценцию и в меньшей степени наувеличение скорости роста A. fischeri (таблица 3, рисунок 12). В интервале между 0.4 и 0.6 Вт/см2значимых изменений свечения бактерий не наблюдали.
Очевидно, что при этих интенсивностяхэффектыподавленияинтенсивностях,и стимуляциипревышающихбиолюминесценции0.6 Вт/см2,оказываютсянаблюдалиравными.необратимоеПриподавлениебиолюминесценции (рисунок 12). Число жизнеспособных клеток прогрессивно уменьшалось.Интенсивность УЗ, при которой начинается подавление биолюминесценции, совпадаетс порогами кавитации в суспензии, что было подтверждено опытами по возникновению УЗкавитационного свечения в среде, свободной от бактериальных клеток, при интенсивностях,больших 0.6 Вт/см2 [29].Таблица 3.
Изменение интенсивности свечения фотобактерий A. fischeri под действием трёхминутной обработкинепрерывным УЗ (M ± m)Интенсивность УЗ (I), Вт/см20 (К) 0.050.10.20.30.40.60.71Интенсивность свечения, отн. ед.21.0± 0.210.0± 0.48.0± 0.420.0± 0.225.0± 0.429.0± 0.426.0± 0.219.0± 0.210.0± 0.269Интенсивность свечения, отн. ед.353025201510500.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.95I,1Вт/см2Рисунок 12.
Изменение люминесценции фотобактерий после воздействия непрерывного УЗ различнойинтенсивности. Пунктиром обозначена интенсивность свечения контрольной культуры.Было изучено также изменение люминесценции в динамике роста бактерий A. fischeriпосле воздействия непрерывного УЗ оптимальной интенсивности 0.4 Вт/см2 на исходнуюсуспензию клеток, использованной для засева питательной среды (то есть на инокулюм,таблица 4).Таблица 4. Влияние непрерывного УЗ на интенсивность базовой активности фотобактерий (M ± m)Время, час0481012141618202224Оптическая0.20.40.81.11.31.51.71.81.922плотность,0.10.30.711.21.41.51.9222отн. ед.3.03.44.24.87.812.27.212205Интенсивность 3.0± 0.4 ± 0.4 ± 0.4 ± 0.4 ± 0.2 ± 0.2 ± 0.2 ± 0.2 ± 0.2 ± 0.4свечения,2.02.22.42.67.29.830.012.84.61.8отн.
ед.2.4± 0.4 ± 0.4 ± 0.4 ± 0.4 ± 0.2 ± 0.2 ± 0.2 ± 0.2 ± 0.4 ± 0.4КонтрольОпытКонтрольОпытПолученные данные, отражающие сложный отклик организма на ростовые процессыграфически представлены на рисунке 13. Наглядно видно, что в результате УЗ воздействиямаксимальная интенсивность свечения клеток в опытном варианте была выше контрольнойи наступала раньше на 4 часа, то есть в опытных посевах свечение наступало сразу же посленакопления необходимой плотности популяции бактериальных клеток, с опережениемотносительно контрольных. Кривые роста в опыте имеют небольшой изгиб через 14–15 ч отмомента посева. Это может свидетельствовать о диауксии: по прошествии первой фазы ростабыло отмечено небольшое его замедление, и затем скорость роста вновь увеличивалась.
Росткультуры через сутки заканчивался стационарной фазой: интенсивность люминесценции послепосева несколько уменьшалась до тех пор, пока число клеток не достигло некоторой пороговой70величины. Затем рост замедлялся и наблюдали характерную аутоиндукцию и подъёмылюминесценции. Для каждой пары из вариантов: контрольного (клетки, не подвергавшиесявоздействию ультразвука) и опытного (клетки, подвергшиеся ультразвуковому воздействию)было зарегистрировано по два максимума интенсивности свечения.
По скорости роста вариантыотличались незначительно, хотя скорость роста контрольных клеток была несколько вышев первый период роста, тогда как для опытных клеток было характерно большее увеличениескорости деления во второй ростовой период. Таким образом, впервые было выявлено, чтоультразвук может быть биостимулятором процессов метаболизма бактерий A. fischeri [139].Время, ч246810121416182022242.5302251.520151100.550Оптическая плотность, отн. ед.Интенсивность свечения, отн. ед.350Интенсивность свечения, контрольОпытОптическая плотность, контрольОпытРисунок 13. Рост и свечение A. fischeri. Регистрация оптической плотности и свечения в процессе роста культурыпосле УЗ воздействия интенсивностью 0.4 Вт/см2 в течение 3 мин.Сопоставление графических результатов влияния непрерывного УЗ и H2O2 (рисунки 11–13)показывает,чтостимулирующеевоздействиеуказанныхагентоводинаковоинтенсифицирует эмиссионную активность A.
fischeri. По-видимому, в жидкой среде в моментоблучения возникает небольшое число перекисных соединений, интенсифицирующих свечениеаналогично 0.00003% H2O2. При этом pH среды не сдвигался ни в кислую, ни в осно́внуюсторону, оставаясь в районе оптимальных значений.В пересчёте на количество жизнеспособных клеток следует считать 0.6 Вт/см2 всё ещёстимулирующейинтенсивностью. Превышениеуровня интенсивностипо отношениюк контролю можно объяснять началом кавитационного УЗ свечения среды, содержащейбелковые эквиваленты, что продемонстрировали опыты по регистрации возникновения свеченияв среде роста после УЗ инсонации в диапазоне интенсивностей свыше 0.6 Вт/см2.71Действие модулированного УЗ на культуру A. fischeriПосле обработки непрерывным УЗ наблюдали двухфазное изменение свечения.
В первыйраз интенсивность свечения после действия УЗ возвращалась к контрольному уровню приобработке 0.2 Вт/см2. Второй раз — наблюдали максимум в диапазоне интенсивностей 0.4–0.6 Вт/см2(рисунок 12выше).Поэтомудляизучениявозможностинаправленногомодулированного воздействия на микроорганизмы были выбраны те же интенсивности УЗ0.2 Вт/см2 и 0.4 Вт/см2, при воздействии которых отмечено увеличение свечения (таблицы 5 и 6).Таблица 5. Изменение эмиссионной активности A. fischeri в зависимости от частоты модуляцииУЗ при интенсивности 0.2 Вт/см2 (M ± m)ν, ГцКонтроль 10–25 35–45 55–65 75–80 85–90 100 120Интенсивность свечения,20.820.919.820.420.825.229.40отн.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
