Диссертация (1151313), страница 16
Текст из файла (страница 16)
В качестве объективной компоненты анализа использоваличисловыезначенияфрактальнойразмерности,полученныев ходеавтоматическогораспознавания в заданном режиме. Фрактальную размерность биологических объектов(количественно характеризующую поведение биологической системы) определяли с помощьюпакета HarFA. В процессе исследования проводили предварительную рентгено-, термическую(минус 20°C, +30°C), ультразвуковую (непрерывный, модуляция) или сочетанную обработкуобразцов крови различных видов животных (кошка, собака, лошадь) in vitro с последующимприготовлением мазков и их окраской дифференциальными красителями. Полученныепрепараты фотографировали со средним разрешением от 72 до 300 пикселей/дюйм,анализировали полученные образы в программе с построением уравнений регрессии, выбором:шага разбиения в диапазоне от 0.1 до 0.001, цветовых комбинаций BW, B+BW, W+BW, анализомизменения фрактальной размерности, амплитуды фрактального спектра и вида гистограмм.После чего анализировали уравнения регрессии и соответствующие графики для определенияфрактальной структуры исследуемых объектов.
Сравнивали сдвиг гистограмм и изменениефрактальной размерности до и после физической обработки.С целью определения чувствительности метода 100 мл крови лошади с введённымантикоагулянтом оставляли на 5 мин при низкой температуре t = –20○С. Визуально никакихизменений не регистрировали. Образцы крови, находящиеся при комнатной температуре t =20○С (контроль), выглядели так же, как и опытные.
Затем сразу же делали мазки, окрашивалии фотографировали для проведения фрактального анализа возможных изменений.Таким образом, нами была впервые адаптирована методика к гематологическимдиагностическим исследованиям. По результатам изучения динамических фрактальных структурбиологических объектов был найден алгоритм работы с цветными изображениями мазков крови,63составлен референтный ряд гистограмм и проведено моделирование колебательных спектровгемограмм в программном пакете HarFA.Биометрическая и статистическая обработка данныхМатематическуюобработкуданныхпроводиласьс помощьюсовременныхкомпьютерных технологий методами математической статистики.
Были использованыприкладные программы пакета «Statistiсa 6.0» фирмы Microsoft. Для построения математическихмоделей использовался пакет CurveExpert 1.4.Полученные данные проверяли на нормальность распределения на основании уравнениягауссовой кривой. Было установлено, что вариационные ряды подчиняются распределениюСтьюдента. Для описания вариационных рядов при равенстве дисперсий использовали методыпараметрической статистики с указанием средних значений и стандартной ошибки среднегозначения (M ± m).
[183]. Для интегральной оценки и анализа влияния изучаемых факторовприменяли методы многофакторного дисперсионного анализа по Фишеру. В некоторых случаях(для контроля) применялся непараметрический критерий Вилкоксона-Мана-Уитни [288].Различия считали статистически значимыми при вероятности нулевой гипотезы p < 0.05.
Связьмежду некоторыми показателями оценивали с помощью корреляционного анализа [61, 68, 105,123, 137]. Оценки корреляционных связей проводили, используя коэффициент r.64III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ6. Действие непрерывного и модулированного ультразвукана модельные объекты§ 6.1. Выбор модельных объектовС конца XX века такой домен прокариот, как археи, находится в фокусе активногоизучения микробиологов, и по некоторым вопросам, в частности в таксономии, опубликованныеданные противоречивы. Например, Т. Дж. МакДженити с соавторами определяют Halobacteriumhalobium как Natrinema pallidum nom. nov.
(NCIMB 777) [326]. В табличных ссылках два видагалобактерий Halobacterium salinarum и Halobacterium halobium Т [320] приводятся в качествеодного вида [326]. Имеются данные и о том, что Halobacterium и Natrinema — два различныхрода в семействе Halobacteriaceae. В последние годы, в соответствии с критериями стандартнойноменклатуры, в составе рода Halobacterium предложен лишь вид salinarum.
Два других вида —H. halobium и H. cutirubrum — тоже отнесены к H. salinarum. Тем не менее, исследователиописывают вновь выделенные штаммы, как и прежде, H. halobium. Не вступая в дискуссиюс упомянутыми исследователями, в настоящей работе считаем указанные наименованияHalobacterium halobium, Halobacterium salinarum и Natrinema pallidum синонимичными,принимая в качестве основного H. halobium.Приизучениистимулирующегои супрессорноговлияниянепрерывногои модулированного УЗ на клетки, модельным объектом служила культура морскихлюминесцирующих бактерий (синоним: светящиеся, фотобактерии) Aliivibrio fischeri (устар.Vibrio fischeri, Alivibrio fischeri). Это преимущественно палочковидные подвижные бактериис клеточной стенкой, красящейся по Граму отрицательно.
Люминесцентная система бактерииобладает способностью к интенсивной световой эмиссии в видимой сине-зелёной областиспектра [58, 235]. Оправданность выбора данного объекта для изучения воздействия былаобусловлена несколькими факторами. Во-первых, успешным применением A. fischeri приизучении разнонаправленных биофизических и биохимических эффектов непрерывного УЗ наклетки тканей различной этиологии в экспериментах, проведённых нами в 1984–1993 гг.
[139].Во-вторых, люцифераза, участвующая в реакциях биолюминесценции светящихся бактерий,используетобычныефакторы —FMNH2и NADHилиNADPH.Поэтому реакции,сопровождаемые испусканием света, могут быть сопряжены со многими биологически важнымиреакциями в организме, а ответ на стимулирующее воздействие легко и быстро регистрируется[48, 75]. И в-третьих, природные и рекомбинантные люминесцирующие бактерии в настоящеевремя стали распространённым инструментом биотестирования поверхностных водоёмов,промышленныхстокови почв,а такжеопределениястепенитоксичностивновь65синтезированных химических соединений и фармацевтических препаратов. Привлекательнойособенностью сенсоров на основе биолюминесценции является то, что они не требуют источникавозбуждения, поскольку свет генерируется в ходе реакции, обеспечивающей чрезвычайновысокую чувствительность.
Не менее важным преимуществом эмиссии света является простотадетектирования и наличие современной аппаратуры для счёта фотонов. Быстродействие,точность и чувствительность к интегральному действию поллютантов — важные особенностилюминесцентных тест-систем [89, 122, 212, 224].Второй модельный объект — архея H. halobium (salinarum; N. pallidum), в зависимости отусловий культивирования фото– либо хемоорганогетеротроф — за счёт природного белкабактериородопсина способна преобразовывать энергию света в электрохимическую энергиюгенерируемых протонов H+ и АТФ [166], что важно для индустрии отечественныхфотопреобразующих наноматериалов и биомолекулярной электроники [7, 131, 334, 335].Бактериородопсин был впервые выделен из клеточной мембраны исследуемой археи в 1971 годуВ. Стохениусом (США) и Д.
Остерхельтом (ФРГ) [340]. В настоящее время бактериородопсинперспективенк использованиюв качествемодельногообъектадляисследованийфункциональной активности и структурных свойств фотопреобразующих белков в составеискусственных энерго– и фотопреобразующих мембран [130]. Для роста архее необходимавысокая освещённость, поэтому для защиты против избыточной радиации и солнечногоизлучения клеточная мембрана, наряду с бактериородопсином, содержит бактериоруберин(каротиноид), липиды и воду [280]. Бактериородопсин выполняет функции светозависимогопротонного насоса, перекачивающего протоны через мембрану клетки и создающегоэлектрохимический градиент протонов Н+. При поглощении света (λмакс 548 нм) происходитобратимая световая фотоизомеризация 13–Z–бактериородопсина в аll–Е–бактериородопсин(λмакс = 568 нм) [131] с последующей цепочкой фотохимических реакций. Оптическиехарактеристики бактериородопсина изменяются в зависимости от условий культивирования.Фотопреобразующие природные наноматериалы представляют большую ценность длянанобиотехнологии,микроэлектроники,биофотоникии биофизическихисследований.В ветеринарии препараты, содержащие бактериородопсин [7], начинают применять принедостатке микроэлементов и витаминов, для нормализации обмена веществ, повышениявыносливости животных при физических нагрузках и ускорения адаптации.
Ряд авторовпоказали, что в настоящее время перспективным при выделении белка из пурпурных мембранвидится обработка бактериальной биомассы ультразвуком (УЗ) частотой 22 кГц [131, 286, 332].66§ 6.2. Рост и эмиссия люминесцирующих бактерий Aliivibrio fischeri в разныхусловияхОпределение оптимальных условий эмиссииПлотность популяцииБыло установлено, что интенсивность биолюминесценции растущих клеток в контролезависитотплотностипопуляции.Максимальнойинтенсивностьюлюминесценциихарактеризуется состояние популяции растущих клеток A. fischeri, называемое «quorum–sensing»[187].
Свечение отсутствовало при малых концентрациях клеток ОП = 0.2–0.3 и резкоувеличивалось и достигало максимума при достижении популяцией критической плотностичерез 20 ч (ОП = 2). Синтезирующийся клетками аутоиндуктор люминесценции, ацильноепроизводное L-гомосерина, N(3’–оксогексаноил)–L–гомосеринлактон, свободно диффундируячерез клеточные мембраны, принимает участие при коммуникативном общении клеток в системе«quorum sensing» и является основным фактором, влияющим на экспрессию lux-генов A.
fischeri[там же].Влияние температуры и рНПоказано, что в физиологических характеристиках морских бактерий A. fischeriпроявляется адаптация к физико-химическим условиям среды обитания. Так, температурныйдиапазон свечения клеток глубинной культуры регистрировали при 10–35°C и в диапазоненачальных значений рН среды 5.5–8.5.
Растущая популяция имела близкие максимальные уровниинтенсивности люминесценции при рН среды 7.0‒7.5 и в диапазоне температур 15‒27°C.Изучение биолюминесценции интактных клеток бактерий показало, что при температурах,превышающих приблизительно на 15°C оптимальные, происходила полная утрата свечения; недетектировали свечения интактных клеток и в области рН инкубационной среды, превышающейвеличину 9.0.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
