Диссертация (1150276), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Полноеотнесение сигналов выполнено с использованием 2D-спектров HSQC и HMBC.96Для структуры II характеристичным является наличие двух сигналовметильных групп в положении 3 (уширенные синглеты при 0,85 и 1,07 м.д.), а такжедвух отдельных сигналов протонов δ-СН2-группы (сложные мультиплеты при2,83–2,99 и 3,05–3,20 м.д.). Это обусловлено появлением в молекуле центрахиральности (асимметрический атом 2-С), что делает эти метильные группы и δпротоны диастереотопными.В протонном спектре структуры III имеются два характерных сигналаолефиновых протонов (при 3,56 и 3,64 м.д.).При увеличении концентрации реагента (I), равновесие сдвигается всторону образования формы (III), что также подтверждается данными ЯМРспектроскопии.
Сдвиг равновесия в сторону образования формы (III) в щелочнойсреде приводит к сдвигу максимума в спектрах возбуждения с 280 до 317 нм. Сдвигмаксимума в видимую область может быть объяснен структурными изменениямив молекуле реагента, а именно, увеличением сопряженной системы за счетдепротонирования метильной группы в положении 2 (Форма III) в щелочной среде.Сопряженнаясистемаструктуры(III)состоитизбензольногокольца,неподеленной пары электронов на атоме азота и двойной связи (C=C) при атомеуглерода в положении 2.Увеличение сопряжения системы приводит не только к сдвигу максимума вспектре возбуждения, но и к увеличению интенсивности флуоресценции (почти на25 % по сравнению с водным раствором исходной формы реагента).
Сопряженнаясистема формы (II) состоит из бензольного кольца и неподеленной парыэлектронов на атоме азота. Сопряженная система формы (II) меньше, чем у формы(III), поэтому интенсивность флуоресценции ниже и максимум в спектревозбуждения соответствует 280 нм.С данными ЯМР спектроскопии согласуются с данные хромато-массспектрометрии.Анализкомбинированнымпроводилиприпомощиквадруполь-времяпролетнымсистемыВЭЖХсмасс-спектрометромсверхвысокого разрешения с ионизацией электроспреем «MaXis» (Bruker Daltonik97GmbH, Germany). В качестве подвижной фазы использовали водный раствор,содержащий 5% ацетонитрила.
Согласно полученным данным, на масс-спектрахпосле хроматографического разделения наблюдали пики двух форм реагента:исходной формы реагента (ТИБС) и формы (III) (Рисунок 48).Рисунок 48. Масс-спектры раствора ТИБС в щелочной среде.Куркумин существует в щелочной среде в енольной форме, котораястабилизирована водородной связью [169]:Предположительно, взаимодействие происходит между формой (III)молекулы реагента и енольной формой куркумина. Наблюдаемый эффект тушенияфлуоресценциивходетакоговзаимодействияможетбытобъясненпротонированием =CH2 группы у атома углерода в положении 2 формы (III)реагента, которое приводит к образованию исходной формы ТИБС.
Сопряженнаясистема исходной формы реагента меньше, чем у формы (III), поэтомунаблюдаемое уменьшение интенсивности флуоресценции реагента усиливается98при увеличении концентрации куркумина. Также доказательством взаимодействиякуркумина именно с формой (III) можно считать данные, полученные методомспектрофлуориметрии. При добавлении куркумина к раствору ТИБС наблюдаетсятушение флуоресценции и не происходит сдвига в спектре возбуждения до 280 нм,что свидетельствует о сдвиге равновесия в сторону образования именно формы(III).Оценивали квантовый выход (ΦF) предлагаемого реагента ТИБС по методу,описанном авторами Williams, Winfield и Miller [170]. Этот метод предполагаетиспользование растворов стандартов, для которых известно значение квантовоговыхода.
Для растворов стандартного и исследуемого образцов, обладающиходинаковой оптической плотностью, можно предположить поглощение равногоколичества фотонов при возбуждении на одной и той же длине волны.Следовательно, соотношение интегрированных интенсивностей флуоресценциидвух растворов, полученных в одинаковых условиях, будет давать соотношениезначений квантовых выходов. Так при известном ΦF для стандартного образца,можно вычислить ΦF исследуемого образца. Таким образом, абсолютные значенияквантовых выходов с использованием стандартных образцов, которые имеютфиксированную и известную величину квантового выхода, можно рассчитать всоответствии со следующим уравнением:,где ST и X обозначают стандартный и исследуемый растворы соответственно.
Grad– угол наклона графика, построенного в координатах интегрированнаяинтенсивность флуоресценции (по у) от оптической плотности (по х) исследуемыхрастворов, η – показатель преломления растворителя.При малых концентрациях ТИБС максимум в спектре возбуждениясоответствует 280 нм, поэтому в качестве стандарта при оценке квантового выходаТИБС использовали водный раствор триптофана (λex=280 нм). Табличное значение99квантового выхода триптофана составляет 0,14 [171].
Рассчитанный по уравнениюквантовый выход реагента составил 0,1 при λex=280 нм.Для автоматизированного определения куркумина была разработана новаягидравлическая схема, включающая мезофлюидное устройство ЦИА (Рисунок 49).Рисунок 49. Гидравлическая схема для определения куркумина: 1 – шприцевойнасос; 2 – многоходовой кран-переключатель; 3 – удерживающий канал; 4 – мезофлюидное устройство; 5 – канал для подачи азота; 6, 7 – перистальтические насосы;8 – детектор.В соответствии с этой схемой, при помощи шприцевого насоса (1) черезмногоходовой кран-переключатель (2) в удерживающий канал (3) последовательноотбирали 10 мкл 0,8 мМ раствора ТИБС, 10 мкл раствора 2 мМ гидроксида натрияи 10 мкл раствора куркумина.
Из удерживающего канала (3) растворыперекачивали в реакционную емкость мезофлюидного устройства (4). Через канал(5) подавали поток азота напрямую в реакционную емкость при помощиперистальтического насоса (6) со скоростью 450 мкл/мин в течение 30 секунд.После завершения перемешивания раствор перемещали из реакционной емкости вкварцевый капилляр оптического канала при помощи перистальтического насоса(7).Измерениеинтенсивностифлуоресценциипроводиливусловиях100остановленного потока.
На следующем этапе все коммуникации системыпромывалидистиллированнойводой.Измерениеаналитическогосигналафонового раствора проводили согласно вышеописанному алгоритму, однако,вместо раствора пробы подавали дистиллированную воду.Общий объем реакционной смеси минимизировали таким образом, чтобыобеспечить минимальный расход реагентов и пробы, сократить сброс послеанализа и обеспечить минимальное значение СКО.
Изучали влияние времениперемешивания растворов в реакционной емкости потоком азота на эффективностьгомогенизации реакционной смеси и полноту протекания реакции. Дляуменьшения времени одного анализа и увеличения производительности, потоказота в реакционную емкость подавали при помощи перистальтического насоса (6)с максимальной рекомендованной производителем скоростью 450 мкл/мин. Времяперемешивания в реакционной емкости варьировали в диапазоне от 20 до 120секунд.
Интенсивность флуоресценции не увеличивалась после 30 секундперемешивания, поэтому эту величину использовали в дальнейших экспериментах.Для увеличения интенсивности возбуждающего излучения в мезофлюидноеустройство ЦИА встраивали два одинаковых светодиода, расположенных на однойоси, с противоположных сторон оптического канала. Согласно рекомендациямпроизводителя, максимально допустимая величина тока, подаваемого на светодиодсоставляет 30 мА.
Для обеспечения продолжительной и стабильной работысветодиодов, в качестве оптимального значения величины подаваемого токавыбрали 25 мА. Напряжение, подаваемое на фотоумножительную трубку,установили исходя из двух критериев: обеспечить максимальный сигнал фоновогораствора, что необходимо в случае тушения флуоресценции, и обеспечитьминимальный шум сигнала. Величина подаваемого на фотоумножительную трубкунапряжения, с учетом вышеописанных критериев составила 0,45 В.При установленных оптимальных значениях тока и напряжения, подаваемыхна светодиоды и фотоумножительную трубку соответственно, провели измеренияградуировочных растворов с различной концентрацией куркумина (Рисунок 50).101Рисунок 50.
Изменение потенциала фотоумножительной трубки для фоновогораствора (0,8 мМ ТИБС, 0,2 мМ NaOH) и градуировочных растворов с различнойконцентрацией куркумина (С(куркумин) от 1 до 10 µМ) во времени.Согласно полученным данным, с ростом концентрации куркумина значенияпотенциала уменьшаются. Градуировочная зависимость потенциала фотоумножительной трубки от концентрации куркумина представлена на рисунке 51.Потенциал, мВ350,0300,0y = -17,591x + 288,92R² = 0,9812250,0200,0150,0100,050,00,0024681012Концентрация куркумина, µМРисунок 51. Градуировочная зависимость потенциала фотоумножительной трубкиот концентрации куркумина, полученная на мезофлюидном устройстве ЦИА.Аналитические характеристики разработанной методики представлены втаблице 12.102Таблица 12.
Аналитические характеристики циклической инжекционнойфлуориметрической методики определения куркумина.ХарактеристикиУстановленное значениеОбъем раствора ТИБС, мкл10Объем пробы, мкл10Объем раствора NaOH, мкл10Суммарный расход реагентов на один анализ, мкл30Предел обнаружения, µM0,3Диапазон определяемых концентраций, µM1 – 10Коэффициент корреляции0,982СКО (n=5), %5,0Производительность, проб/час24Для оценки селективности разработанной методики определения куркуминас применением мезофлюидного устройства ЦИА исследовали влияние наиболеераспространенных соединений, оказывающих мешающее влияние при анализебиологически активных добавок.
Изучали влияние некоторых катионов и анионов,которые могут входить в их состав. Для оценки мешающего влиянияпоследовательно готовили и анализировали смешанные растворы куркумина (0,04мМ) и примесных веществ с различными концентрациями. Считали, что примесноевещество оказывает мешающее влияние на определение, если различиеаналитических сигналов растворов, приготовленных с добавлением и в отсутствиепримесного вещества, составляет более 5%.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
