Диссертация (1150276), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Измеряли оптические плотностиприготовленных растворов при λ=820 нм. Из полученных данных (Рисунок 32)следует, что аналитический сигнал максимален, начиная с концентрации реагента,равной 0,2 мМ.0,6Оптическая плотность0,50,40,30,20,10,00,00,10,20,30,40,50,6С(18-МФА), мМРисунок 32. Зависимость оптической плотности восстановленной формы18-МФА, образующейся по реакции с эпинефрином от концентрации 18-МФА(C (эпинефрин) = 0,1 мМ; pH = 7,0; λ = 820 нм; l = 10 мм).Для автоматизированного определения эпинефрина была разработана новаягидравлическая схема циклического инжекционного фотометрического анализа,включающая мезофлюидное устройство (Рисунок 33). В соответствии с этойсхемой, с помощью шприцевого насоса (1) через многоходовой кранпереключатель (2) в удерживающий канал (3) последовательно отбирали 10 мкл 0,2мМ раствора 18-МФА, 10 мкл раствора эпинефрина и 20 мкл фосфатногобуферного раствора (рН=7,0).
Растворы из удерживающего канала (3) при смененаправлениядвиженияпоршняшприцевогонасоса (2) перекачивали в67реакционную емкость мезофлюидного устройства (4). Растворы перемешивали вреакционной емкости потоком аргона в течение 60 секунд. После этого при помощиперистальтического насоса (5) раствор из реакционной емкости перекачивали воптический канал для измерения оптической плотности в режиме остановленногопотока. Затем проводили промывку коммуникаций буферным раствором иизмеряли оптическую плотность «холостой» пробы.Рисунок 33. Гидравлическая схема для определения эпинефрина и цистеина (см.Главу 3.3): 1 – шприцевой насос; 2 – многоходовой кран-переключатель; 3 –удерживающий канал; 4 – мезофлюидное устройство, 5 – перистальтический насос;6 –спектрометр.Объемы реагентов, поступающие в реакционную емкость, минимизировалис учетом следующих критериев: сократить объемы растворов пробы, реагента иобразующихся отходов, но при этом обеспечить минимальное значение СКО.При реализации методики на мезофлюидном устройстве циклическогоинжекционного фотометрического анализа, одним из важнейших параметровоптимизации условий проведения аналитической реакции является времяперемешивания растворов в реакционной емкости.
От времени перемешиваниязависит полнота протекания аналитической реакции. Зависимость оптическойплотности раствора аналитической формы от времени перемешивания вреакционнойемкостипредставлена нарисунке34. Сравниваяусловия68перемешивания растворов в реакционной емкости потоком атмосферного воздухаи потоком аргона, можно утверждать, что в случае использования инертного газа,значения оптических плотностей выше в 1,5 раза. Такое различие можно объяснитьокислением эпинефрина под действием кислорода воздуха.
В последующихэкспериментах для перемешивания растворов использовали аргон.Экспериментально установлено, что оптимальное время перемешиваниярастворов реагентов в реакционной емкости мезофлюидного устройства аргономсоставляет 60 секунд при скорости подачи газа в реакционную емкость 0,1 мл/мин.При больших скоростях потока газа наблюдалось вытеснение растворов изреакционной емкости.АргонВоздух0,24Оптическая плотность0,200,160,120,080,040,0030405060708090Время перемешивания, сРисунок 34.
Зависимость оптической плотности восстановленной формы18-МФА, образующейся по реакции с эпинефрином от времени перемешиванияпотоками различных газов (воздух, аргон) в мезофлюидном устройстве ЦИА(С (эпинефрин)= 0,1 мМ, С (18-МФА) = 0,2 мМ; pH = 7,0; λ = 820 нм; l = 36 мм).С целью сравнения аналитических возможностей новой и традиционной схемЦИА [104] также проводили определение эпинефрина с помощью последней(Рисунок 35). Согласно традиционной схеме ЦИА, через многоходовой кранпереключатель (1) с помощью реверсивного перистальтического насоса (2) вреакционную емкость (3) подавали 240 мкл 0,2 мМ раствора 18-МФА, 180 мклраствора эпинефрина и 300 мкл фосфатного буферного раствора (рН= 7,0).69Растворы перемешивали в реакционной емкости потоком аргона, подаваемого припомощи перистальтического насоса в течение 60 секунд.
После этого, раствор изреакционной емкости при смене направления вращения насоса, перекачивали впроточную кювету (длина оптического пути 50 мм) (4) спектрометра.Коммуникации системы промывали буферным раствором и измеряли оптическуюплотность «холостой пробы».Рисунок 35. Гидравлическая схема ЦИА: 1 – многоходовой кран-переключатель;2 – реверсивный перистальтический насос; 3 – реакционная емкость; 4 – проточнаякювета спектрометра.Аналитические характеристики разработанных методик представлены втаблице 4.70Таблица 4.
Аналитические характеристики методик циклическогоинжекционного фотометрического определения эпинефрина.ХарактеристикиМезофлюидноеТрадиционнаяустройство ЦИАсхема ЦИАОбъем пробы, мкл10180Объем раствора 18-МФА, мкл10240Объем буферного раствора, мкл20300Суммарный расход реагентов на один анализ, мкл40720Предел обнаружения, µМ (3σ)0,50,51,5 – 301,5 – 300,9960,994СКО (n=5), %4,95,1Производительность, проб/час1020Диапазон определяемых концентраций, µМКоэффициент корреляцииИсследоваливлияниенекоторыхсоединений,обладающихвосстановительными свойствами и компонентов, входящих в состав инъекционныхлекарственных форм. Для этого последовательно готовили и анализировалисмешанные растворы эпинефрина (10 µМ) и примесных веществ с различнымиконцентрациями.
Считали, что примесное вещество оказывает мешающее влияниена ход фотометрической реакции, если различие аналитических сигналоврастворов, приготовленных с добавлением и в отсутствие примесного вещества,составляет более 5%. Используя полученные данные, рассчитывали факторселективности для каждого индивидуального компонента. Фактор селективности –отношение концентрации компонента, начиная с которой аналитический сигнализменяется более чем на 5%, к концентрации эпинефрина в растворе [158].
Каквидно из таблицы 5 в наибольшей степени мешают определению эпинефринааскорбиновая кислота, цистеин, норэпинефрин и метилдопа. В ампулахлекарственных препаратов, содержащих эпинефрин, в качестве консерванта,предотвращающего окисление действующего вещества, используют дисульфитнатрия, который оказывает влияние на определение эпинефрина. Мешающеевлияние консерванта устраняли при подкислении раствора инъекционной71лекарственной формы, содержащего эпинефрин, с последующим удалениемдиоксида серы при пропускании аргона через раствор. Не мешают определениюэпинефрина ацетилсалициловая кислота, и соединения, которые используются влекарственных препаратах в качестве вспомогательных (стеарат магния,этилендиаминтетрауксусная кислота и хлорид натрия).Таблица 5.
Влияние примесных компонентов на определение 10 µМ эпинефрина.КомпонентФактор селективностиNa+, K+, Mg2+, Ca2+10000а)NO3-, SO42-, PO43-,Cl-10000а)Cu 2+, Fe 2+8Na2SO3∙H2O700Na2S2O3∙5H2O300KNaC4H4O6∙4H2O700N-(4-гидроксифенил)ацетамид1000Лимонная кислота700Мочевая кислота5Салициловая кислота700а)Ацетилсалициловая кислота700а)Норэпинефрин0,2Метилдопа0,2Цистеин0,2Аскорбиновая кислота0,2а)а)а)Примечание: а) – максимальная из исследованных концентрацийРазработанная методика определения эпинефрина по реакции с 18-МФА намезофлюидном устройстве ЦИА была апробирована при анализе лекарственныхпрепаратов адреналина гидрохлорида (Московский эндокринный завод, Россия) иадреналина гидротартрата («Здоровье», Харьков, Украина).
Для этого вскрывали 5ампул, содержащих раствор для инъекций по 1 мл, в каждой ампуле. Помещалисодержимое ампул в химический стакан, перемешивали. Для устранениямешающего влияния дисульфита натрия, раствор подкисляли, добавляли 1 мл720,01 М раствора HCl и пропускали поток аргона через раствор в течение 5 минут.Подготовленный таким образом раствор вводили в мезофлюидное устройствоЦИА. Результаты определения эпинефрина в мезофлюидном устройстве ЦИАсравнивалисрезультатами,полученнымипоадаптированнойметодикеобращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) соспектрофотометрическим детектированием при длине волны 210 нм [159].
Анализпроводили на хроматографе Shimadzu LC-20 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan).Хроматографическое разделение проводили на колонке Supelco C18 (250 × 4,6 мм,5 мкм). Колонку термостатировали при температуре 40 °C, скорость элюентасоставляла 1,5 мл/мин. В качестве подвижной фазы использовали раствор,содержащий 0,085% фосфорной кислоты и 1% триэтиламина.Результаты определения эпинефрина, полученные по разработанной иреферентнойметодикам,представленывтаблицеДля6.сравнениявоспроизводимости результатов двух методик использовали тест Фишера (F-тест,Fкритическое(n1=5, n2=5, P=0,95) = 6,39). Тестовой статистикой служит отношениедисперсий сравниваемых серий результатов: F (n1, n2, P) =1222.
Если отношениедисперсий F меньше критического значения коэффициента Фишера, это означает,чторазличиемежду12и22незначимо,дисперсииоднородныивоспроизводимость обеих серий одинакова. F критическое (n1=5, n2=5, P=0,95) = 6,39.Полученные значения F˂ Fкритическое,следовательно, воспроизводимостьрезультатов, полученных по разработанной и референтной методикам, одинакова,дисперсии однородны.
Для оценки правильности результатов (т.е. отсутствия илиналичия систематической погрешности) использовали модифицированный тестСтьюдента (t-тест). Тестовая статистика вычисляется следующим образом:|х̅1 −х̅2 |̅ ()1 2√1 +2. Если полученное значение не превышает критическое значениекоэффициента Стьюдента, это означает, что различие между средними значениямирезультатов сравниваемых серий не значимое и систематическая погрешностьотсутствует. tкритическое(n1+n2−2=8, P=0,95)= 2,31 Полученные значения73t˂ t критическое, это означает, что различия между результатами анализа, полученнымипо разработанной и референтной методикам не значимы, т.е. не превышаютуровень случайной погрешности и систематическая погрешность отсутствует[160].Таблица 6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
