Диссертация (1150276), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Результаты определения эпинефрина в инъекционных лекарственныхформах (n1 = 5, n2 = 5, P = 0,95).ПробаАдреналингидрохлорид(Московскийэндокринныйзавод)Адреналинагидротартрата(«Здоровье»,Украина)Сертифицированноесодержание,мг/мл1,001,82Найдено, мг/млМезофлюидноеВЭЖХустройство ЦИА0,972±0,0590,985±0,0551,796±0,0611,803±0,056F-тестt-тест3,780,162,501,86Сравнение аналитических характеристик разработанных и известныхпроточных фотометрических методик определения эпинефрина представлено втаблице 7. В ходе сравнения было установлено, что разработанная методика намезофлюидном устройстве ЦИА по чувствительности превосходит многиепроточные аналоги.
Это связано как с выбором фотометрического реагента, так и сиспользуемым проточным методом. Проигрыш в производительности в случаемезофлюидного устройства ЦИА обусловлен необходимостью последовательногоотбора пробы и реагентов в удерживающий канал с помощью шприцевого насоса.В отличие от ПИА, который относится к диффузионно-конвективным проточнымметодам, в ЦИА отсутствует дисперсия пробы в потоке носителя, что приводит кувеличению чувствительности анализа. Следует отметить, что мезофлюидноеустройство ЦИА позволило в почти в 20 раз сократить суммарный расходрастворов на один анализ по сравнению с традиционной схемой ЦИА, при этомчувствительность анализа осталась на прежнем уровне. Предел обнаружения (3σ)в обоих случаях составил 0,5 µМ.74Таблица 7. Сравнение аналитических характеристик разработанных и известных методик проточного фотометрическогоопределения эпинефрина.ПроточныйметодОбъект анализаРеагентПИАЛекарственныепрепаратыПИАПИАПИАПИАЦИАМУ ЦИАЛекарственныепрепаратыМодельныерастворыИнъекционныелекарственныеформыЛекарственныепрепаратыИнъекционныелекарственныеформыИнъекционныелекарственныеформыОбъемпробы,мклКоличествоанализов в часДиапазонопределяемыхконцентрацийПределобнаруженияЛитератураП-толуидин –периодат натрия15018027 – 383 µМ3,8 µМ[116]Периодат натрия20012020 – 200 µМ0,4 µМ[117]Гидроксид натрия--2,0 – 30 ppm-[118]Иммобилизованный диоксид свинца375130100 – 800 µМ8 µМ[119]Fe (II) –аминоацетатнокарбонатныйбуферный раствор21012027 – 1000 µМ5,5 µМ[120]18-МФА180201,5 – 30 µМ0,5 µМ[107]18-МФА10101,5 – 30 µМ0,5 µМДаннаяработаПримечание: ПИА – проточно-инжекционный анализ; ЦИА ‒ циклический инжекционный анализ; МУ – мезофлюидное устройство.753.3.
Проточное фотометрическое определение цистеинаДля фотометрическоговозможностьиспользованияопределения цистеина была также18-МФА.Следуетизученаотметить,чтогетерополикомплексы структуры Доусона находят широкое применение длябиохимического анализа, в частности гетерополианион 18-вольфрамодифосфатадлительное время использовался, как основной реагент, для определения цистеинаи цистина [161-165]. В данной работе впервые исследовали возможностьприменения 18-МФА для определения цистеина.Дляустановлениястехиометрииреакциивосстановления18-МФАцистеином и состава восстановленной формы 18-МФА использовали методымолярных отношений и изомолярных серий.
Было выявлено образованиедвухэлектронной восстановленной формы 18-МФА, а соотношение аналит:реагентсоставило 2:1. Таким образом, в полуреакции восстановления одной молекулы 18МФА участвуют два электрона, и в полуреакции окисления двух молекул цистеинаучаствуют два электрона. Окислительно-восстановительная реакция, протекающаямежду 18-МФА и цистеином, описывается следующим уравнением:Спектр поглощения восстановленной формы 18-МФА представлен нарисунке 36.
Молярный коэффициент светопоглощения составил 6·103л∙моль-1∙см-1.760,6Оптическая плотность0,50,40,30,20,10,050060070080090010001100Длина волны () нмРисунок 36. Спектр поглощения восстановленной формы 18-МФА, образующейсяпо реакции восстановления 18-МФА цистеином (С (18-МФА) = 0,4 мМ, рН=5,0; λ= 820 нм; l = 10 мм).Полнота протекания реакции между 18-МФА и цистеином также в большойстепени зависит от рН-раствора. Изучали зависимость оптической плотностивосстановленной формы 18-МФА, полученной в ходе реакции с цистеином от рН.Для этого в колбу объемом 10 мл помещали 2,5 мл 0,4 мМ раствора 18-МФА, 3 мл0,1 мМ раствора цистеина гидрохлорида и 2 мл ацетатного буферного растворарН=5,0 и доводили до объема 10 мл дистиллированной водой. Кислотностьрастворов контролировали при помощи рН-метра и изменяли с помощью 0,5 Мгидроксида аммония и 0,5 М раствора соляной кислоты.
Полученные растворыперемешивали в течение 5 минут, помещали в кювету (длина оптического пути 10мм) и измеряли оптическую плотность раствора восстановленной формы 18-МФАотносительно раствора сравнения при длине волны 820 нм.При рН>7,5 (Рисунок 37) исходный гетерополикомплекс (18-МФА)подвергается гидролизу, а при рН<4,5 аналитическая реакция кинетическизамедлена. Максимальная оптическая плотность раствора аналитической формынаблюдается в диапазоне рН от 5 до 7,5. При рН=7,5 аналитическая форма современем разрушается, к тому же усиливается гидролиз самого реагента.
Поэтомув качестве оптимального значения рН было выбрано значение рН=5,0.77Рисунок 37. Зависимость оптической плотности восстановленной формы 18-МФА,образующейся по реакции восстановления 18-МФА цистеином от рН раствора.(C (цистеин) = 0,1 мМ, С (18-МФА) = 0,4 мМ, λ = 820 нм, l = 10 мм).На следующем этапе проводили выбор оптимальной концентрациифотометрического реагента 18-МФА при значении рН=5,0. Для этого в мерныеколбы объемом 10 мл помещали 3 мл 0,1 мМ раствора цистеина, 2 мл ацетатногобуферного раствора рН=5,0; 2,5 мл раствора 18-МФА (концентрация от 0,1 до 0,6мМ) и доводили до объема 10 мл дистиллированной водой.
Из полученных данных(Рисунок 38) видно, что аналитический сигнал максимален, начиная сконцентрации реагента, равной 0,4 мМ.Рисунок 38. Зависимость оптической плотности восстановленной формы 18-МФА,образующейся по реакции восстановления 18-МФА цистеином от концентрации18-МФА (C (цистеин) = 0,1 мМ, pH = 5,0; λ = 820 нм; l = 10 мм).78Дляавтоматизированногоопределенияцистеинаиспользовалигидравлическую схему, представленную на рисунке 33. Через многоходовой кранпереключатель (1) с помощью шприцевого насоса (2) в удерживающий канал (3)последовательно отбирали 10 мкл 0,4 мМ раствора 18-МФА, 10 мкл раствора пробыи 10 мкл ацетатного буферного раствора (рН=5,0).
Растворы из удерживающегоканала (3) при смене направления движения поршня шприцевого насоса (2)перекачивали в реакционную емкость мезофлюидного устройства (4), гдепроисходило их перемешивание. После этого изменяли положение кранапереключателя (5) и раствор перекачивали в оптический канал, в которомпроизводили измерение оптической плотности. Далее выполняли промывкукоммуникацийбуфернымрастворомиизмерялиоптическуюплотность«холостой» пробы.Для сравнения аналитических возможностей мезофлюидного устройствациклического инжекционного фотометрического анализа было изготовленомезофлюидноеустройство,функционирующеенапринципахпроточно-инжекционного фотометрического анализа. Мезофлюидное устройство проточноинжекционного анализа было изготовлено из ПММА с применением фрезернойтехнологии (Рисунок 39).Рисунок 39. Схема изготовления мезофлюилного устройства для миниатюризациипроточно-инжекционного анализа.
А-Г – этапы изготовления мезофлюидногоустройства.79Для изготовления мезофлюидного устройства проточно-инжекционногофотометрического анализа в графическом редакторе Cut2D ver. 1,6 был выполненчертеж. При помощи автоматизированного станка KitMillRD 300/420 (OriginalmindCo., Япония) на пластинке из ПММА (52 × 34 × 10 мм) вырезали каналы всоответствии с чертежом (Рисунок 39 А, Б), производили герметизацию каналовпутем склеивания с покровной пластиной (Рисунок 39 В), просверливали отверстиядля крепления источника света и детектора, фиксировали трубки (PEEK,внутренний диаметр 0,5 мм) для подачи и сброса растворов (Рисунок 39 Г).Топологиямезофлюидногоустройствапроточно-инжекционногофотометрического анализа включает в себя четыре основных канала (ширина 0,8мм, глубина 0,8 мм) (Рисунок 40): каналы для ввода растворов пробы и реагента (1,2); канал, выполненный в форме меандра (3), предназначенный для смешениярастворов пробы и реагента и образования аналитической формы в потоке;оптический канал (4), в котором происходило измерение оптической плотности(длина оптического пути 36 мм).Рисунок 40.
Топология мезофлюидного устройства для миниатюризациипроточно-инжекционного фотометрического анализа: 1 – канал для вводабуферного раствора и пробы; 2 – канал для ввода раствора реагента; 3 – канал,выполненный в форме меандра; 4 – оптический канал; 5 – отверстие для источникасвета; 6 – линза; 7 – светодиод; 8 – спектрометр, 9 – сброс.80В качестве источника света использовали светодиод (LED 820-01AU,Roithner Laser Technik, Австрия), излучающий свет при длине волны 820 нм, передкоторым размещали шарообразную линзу (диаметр 0,5 мм (nR = 1,517) (BL-05,Edmund Optics, США) для усиления фокусировки света на оптический канал. Вкачестве детектора использовали портативный спектрометр, оптоволоконныйкабель которого был закреплен на устройстве.
Мезофлюидное устройствопомещали в черный чехол, который представлял собой куб с черными стенками.Проточно-инжекционное определение цистеина проводили согласно схеме,представленной на рисунке 41. Шприцевые насосы (1, 2) заполняли ацетатнымбуферным раствором и 0,4 мМ раствором 18-MФA, затем в каналы мезофлюидногоустройства (3) подавали со скоростью 0,5 мл/мин соответствующие растворы. Вканале, выполненном в форме меандра, смешивались растворы 18-MФA ибуферный раствор.
Смешанный раствор через оптический канал поступал на сброс,при этом измеряли фоновый сигнал. Через каждые 5 секунд кран-дозатор (4) менялсвое положение, и в поток ацетатного буферного раствора инжектировали растворпробы с помощью перистальтического насоса (5).Рисунок 41. Гидравлическая схема для проточно-инжекционного определенияцистеина: 1, 2 – шприцевые насосы; 3 – мезофлюидное устройство; 4 – кранпереключатель; 5 – перистальтический насос; 6 – спектрометр.81Важным параметром в ПИА является объем инжектируемой пробы, откоторого зависит и дисперсия, и величина аналитического сигнала. В потокацетатного буферного раствора инжектировали от 30 до 100 мкл 0,1 мМ растворацистеина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
