Диссертация (1150276), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Установлено, что с увеличением объема пробы аналитический сигналвозрастает, и достигает максимального значения при объеме пробы 50 мкл,который и был выбран для дальнейших исследований. После инжектированияпробы, в канале мезофлюидного устройства образовывалась аналитическая форма,оптическая плотность которой пропорциональна концентрации цистеина.Аналитические характеристики методик определения цистеина по реакции с18-МФА, реализованныхна мезофлюидныхустройствахЦИА иПИА,представлены в таблице 8.Таблица 8. Аналитические характеристики проточных фотометрических методикопределения цистеина.ХарактеристикиМезофлюидноеМезофлюидноеустройство ЦИАустройство ПИАОбъем пробы, мкл1050Объем раствора 18-МФА, мкл10125Объем буферного раствора, мкл10125Суммарный расход реагентов на один анализ, мкл30300Предел обнаружения, µМ (3σ)3610 – 10020 – 1000,9970,991Диапазон определяемых концентраций, µМКоэффициент корреляцииСКО (n=5), %4,95,2Производительность, проб/час12240Для изучения влияния компонентов, потенциально содержащихся вбиологически активных добавках, выполнили специальную серию экспериментов.Последовательно готовили и анализировали смешанные растворы цистеина ипримесных веществ с различными концентрациями.
Считали, что примесноевещество оказывает мешающее влияние на ход фотометрической реакции, еслиразличие аналитических сигналов растворов, приготовленных с добавлением и в82отсутствие примесного вещества, составляет более 5%. Используя полученные врезультате экспериментов данные, рассчитывали фактор селективности длякаждого индивидуального компонента.
Мешающее влияние при определениицистеинапореакциис18-МФАоказываютсоединения,проявляющиевосстановительные свойства. Соединения и их концентрации, оказывающиемешающее влияние при определении цистеина по реакции с 18-МФАпредставлены в таблице 9. Существенное влияние оказывает аскорбиновая кислотапри содержании 0,02 мМ и выше, в то же время содержание 7 мМ салициловой илимонной кислот не оказывает существенного влияния на аналитический сигнал.Таблица 9. Влияние примесных компонентов на определение 0,04 мМ цистеина.КомпонентФактор селективности*Na+, K+, Mg2+, Ca2+2500а)NO3-, SO42-, PO43-,Cl-2500а)SO32-, C4H4O62-,175а)S2O32-75Парацетамол250а)Лимонная кислота175а)Салициловая кислота175а)Ацетилсалициловая кислота175а)Норэпинефрин5Эпинефрин5Аскорбиновая кислота5Примечание: *Фактор селективности – отношение концентрации компонента, начиная с которойаналитический сигнал изменяется более чем на 5%, к концентрации цистеина в растворе.а)– максимальная из исследованных концентрацийРазработанныеметодикиопределенияцистеинасприменениеммезофлюидных устройств (МУ) ЦИА и ПИА были апробированы на реальныхобъектах.
Были проанализированы биологически активные добавки (БАД) к пище«Now foods» (США) и «Twinlab» (США). Пробоподготовка в большинстве случаев83[131, 132, 129, 108, 166] заключается в растворении пробы в воде и фильтрацииполученного раствора. В статье [130] авторы предлагают добавлять 0,01 М растворNaOH для растворения цистеина.Результаты определения, полученные по методикам, реализованным намезофлюидныхустройствахЦИАиПИА,сравнивалисрезультатами,полученными методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием придлине волны 254 нм [168]. Методика ВЭЖХ предусматривает предварительнуюдериватизациюцистеинасфенилизотиоцианатом.Хроматографическоеразделение проводили на колонке Supelco C18 (250 × 4.6 мм, 5 мкм).
Колонкутермостатировали при температуре 40 °C, использовали градиентное элюированиесо скоростью 1,2 мл/мин. В качестве подвижной фазы использовали растворацетонитрила, содержащий 6 мМ ацетата натрия (рН=5,5) и 1% изопропанола. Дляпостроения градуировочной зависимости 15, 25, 50, 100 и 150 мкл 0,01 М растворацистеина помещали в 5 виал и высушивали потоком воздуха при температуре 65°C. Далее добавляли 0,1 мл 0,15 M раствора NaOH и виалы тщательно встряхивали.К полученному раствору добавляли 0,35 мл 5% раствора фенилизоцианата визопропаноле и 0,5 мл бидистиллированной воды. Раствор выпаривали притемпературе 60 °C в течение 15 минут.
Полученный осадок растворяли в 1 млбидистиллированной воды, фильтровали и инжектировали в хроматографическуюсистему.Результаты разработанных методик на мезофлюидных устройствах ЦИА иПИА сравнивали с результатами определения цистеина по референтной методике(Таблица 10).
Для сравнения воспроизводимости результатов двух методикиспользовали тест Фишера (F-тест, FоценкиправильностиСтьюдента (t-тест). tрезультатовкритическоекритическое(n1=5, n2=5, P=0,95) = 6,39). Дляиспользовалимодифицированныйтест(n=8, P=0,95) = 2,31. Полученные значенияt˂ t критическое, следовательно, различия между результатами анализа, полученнымипо разработанной и референтной методикам не значимы.84Таблица 10.
Результаты определения цистеина в биологически активныхдобавках(n1 = 5, n2 = 5, n3 = 5, P = 0,95).ПробаНайдено, гСертифицированноесодержание,МУ ЦИАМУ ПИАВЭЖХгМУ ЦИА иМУ ПИА иВЭЖХВЭЖХF-t-F-t-тесттесттесттест«Nowfoods»0,50,491 ± 0,061 0,487 ± 0,065 0,492 ± 0,0541,270,292,600,620,50,493± 0,0592,780,734,181,11(США)«Twinlab»0,489 ± 0,0640,495± 0,055(США)Сравнение аналитических характеристик разработанных и известныхпроточных фотометрических методик определения цистеина представлено втаблице 11. В ходе сравнения было установлено, что разработанные методики сприменением мезофлюидных устройств по чувствительности сопоставимы сизвестными аналогами, а по производительности, методика, разработанная сприменением мезофлюидного устройства ПИА, превосходит существующиеаналоги в 10 раз.
Производительность разработанной методики ПИА составляет240 определения в час. Однако, чувствительность проточно-инжекционногоопределения цистеина уступает ЦИА из-за дисперсии пробы (коэффициентдисперсии равен 2) в потоке носителя. ЦИА уступает по производительности ПИА,что далеко не во всех случаях применения автоматизированных методик анализаможет считаться недостатком.
Необходимость анализа сотен проб возникает вопределенных случаях, например, при непрерывном экологическом мониторингеводных сред. В большинстве возможных областей применения подобных методиктребуется производительность на уровне десятков образцов в смену, что легкообеспечивает ЦИА. Следует отметить, что мезофлюидное устройство ЦИАпозволило сократить в 10 раз суммарный расход реагентов на одно определение посравнению с устройством ПИА (Таблица 8).
Кроме того, топология мезофлюидного85устройства ЦИА является универсальной – не зависит от количества используемыхрастворов реагентов. Топология мезофлюидных устройств ПИА, как правило,индивидуальная и зависит от особенностей автоматизируемой методики анализа.Таблица 11. Сравнение аналитических характеристик разработанных и известных методик проточного фотометрическогоопределения цистеина.ПроточныйметодПИАПИАОбъект анализаЛекарственныепрепаратыЛекарственныепрепараты,средства дляукладки волосФотометрическийреагенто-Фталевый альдегидN-ацетилцистеин5,10,15,20-тетракис(4Nтриметиламмониофенил)Автокаталитическаяреакционная системаNa2SO3/H2O2Объемпробы,мклКоличествоопределений вчасДиапазонопределяемыхконцентраций,µМПределобнаружения,µМЛитература-30100 – 270-[130]10300,2–80,12[131]--0,2–100,14[132]ПИАМодельные смесиSIAПроцессферментациипекарскихдрожжейS.
cerevisiaeFe (II) ортофенантролин25-12515100–10005[129]ЦИАБАД, комбикорм18-МФА2002010 – 1003[108]МУ ЦИАБАД18-МФА101210 – 1003[166]МУ ПИАБАД18-МФА5024010 – 1006ДаннаяработаПримечание: ПИА – проточно-инжекционный анализ; SIA ‒ последовательный инжекционный анализ; ЦИА ‒ циклический инжекционныйанализ; МУ – мезофлюидное устройство; БАД – биологически активные добавки; 18-МФА – 18-молибдодифосфат аммония.87Глава 4.
Миниатюризация циклического инжекционногофлуориметрического анализа4.1. Изготовление мезофлюидного устройства для миниатюризациициклического инжекционного флуориметрического анализаМезофлюидноеустройствоциклическогоинжекционногофлуориметрического анализа было изготовлено из трех комбинированныхпластинок ПММА с использованием фрезерной технологии (Рисунок 42).Рисунок 42. Схема изготовления мезофлюидного устройства циклическогоинжекционного флуориметрического анализа. А, Б, В – пластинки из ПММА; а-л –этапы изготовления мезофлюидного устройства.Каждая ПММА пластинка состояла из двух частей: прозрачной (50 × 20 ×10 мм) и черной, непрозрачной (50 × 50 × 10 мм).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
