Диссертация (1145986), страница 35

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 35)

Тогда:(А.17)146z (t ) = [ RC ]0 −[ RC ]0(k −1+ k + 2+ k ′+1) − 4 ⋅k ′+1⋅k + 22{(λ + k1}+ k + 2+ k ′+1) ⋅ e λ1t − (λ2 + k −1+ k + 2+ k ′+1) ⋅ e λ2t (А.18)−1Упростим выражение (А.18):(k −1+ k +2+ k ′+1) + (k −1+ k +2+ k ′+1) 2 − 4 ⋅k ′+1⋅k +2λ1 + k −1+ k +2+ k ′+1== −λ2 ≡ a 22λ2 + k −1+ k +2+ k ′+1=(k −1+ k +2+ k ′+1) − (k −1+ k +2+ k ′+1) 2 − 4 ⋅k ′+1⋅k +2= −λ1 ≡ a12z (t ) = [ RcAMP](t ) = [ RC ]0 −[ RcAMP] = [ RC ]0 −[ RC ]0(k −1+ k +2+ k ′+1) − 4 ⋅k ′+1⋅k +22[ RC ]0(k −1+ k +2+ k ′+1) − 4 ⋅k ′+1⋅k +22{a⋅ a2 ⋅ e −a1t +2⋅ e −a1t − a1 ⋅ e −a2t}[ RC ]0(k −1+ k +2+ k ′+1) − 4 ⋅k ′+1⋅k +22⋅ a1 ⋅ e −a2tk −1+ k +2+ k ′+11+  ⋅ e −a1t +[ RcAMP] = [ RC ]0 − [ RC ]0  2 ⋅ (k + k + k ′ ) 2 − 4 ⋅k ′ ⋅k2−1+2+1+1 + 21k −1+ k +2+ k ′+1+ [ RC ]0 −  ⋅ e −a2t 2 ⋅ (k + k + k ′ ) 2 − 4 ⋅k ′ ⋅k2−1+2+1+1 + 2Разложим в ряд выражение(А.19)(k −1+ k + 2+ k ′+1) 2 − 4 ⋅k ′ +1⋅k + 2 и оставим два первых члена ряда.(k −1+ k +2+ k ′+1) 2 − 4 ⋅k ′+1⋅k +2 = (k −1+ k +2+ k ′+1) ⋅ 1 −4 ⋅k ′+1⋅k +2=(k −1+ k +2+ k ′+1) 223 14 ⋅k ′+1⋅k +21 1  4 ⋅k ′+1⋅k +2  1 1 3  4 ⋅k ′+1⋅k +2   − ⋅ ⋅ ⋅  K ≈= (k −1+ k +2+ k ′+1) ⋅ 1 − ⋅− ⋅ ⋅ 2 2 2 2 (k −1+ k +2+ k ′+1) 2 4  (k −1+ k +2+ k ′+1)  2 4 6  (k −1+ k +2+ k ′+1)  2 ⋅k ′+1⋅k +2(А.20)≈ ( k −1+ k +2+ k ′ +1) −k −1+ k +2+ k ′+1Тогда:1) a1 =≈2)(k −1+ k +2+ k ′+1) − (k −1+ k +2+ k ′+1) 2 − 4 ⋅k ′+1⋅k +2≈2(k −1+ k +2+ k ′+1) − (k −1+ k +2+ k ′+1) +2 ⋅k ′+1⋅k +2k −1+ k +2+ k ′+12k −1+ k + 2+ k ′+12 ⋅ (k −1+ k + 2+ k ′+1) 2 − 4 ⋅k ′+1⋅k +2+1≈2=k ′+1⋅k +2k −1+ k +2+ k ′+11k −1+ k +2+ k ′+1+ =2 ⋅k ′+1⋅k +2  22 ⋅  (k −1+ k +2+ k ′+1) −′k+k+k−1+2+1 (А.21)1472 ⋅k ′+1⋅k +22 ⋅k ′+1⋅k +21k −1+ k +2+ k ′+1k −1+ k +2+ k ′+1=++ =2 ⋅k ′+1⋅k +2 2 ⋅k ′+1⋅k +2  2 2 ⋅  (k −1+ k +2+ k ′+1) −2 ⋅  (k −1+ k +2+ k ′+1) −k −1+ k +2+ k ′+1 k −1+ k +2+ k ′+1 k ′+1⋅k +2= 1+(k −1+ k + 2+ k ′+1) 2 − 2 ⋅k ′+1⋅k + 2(k −1+ k +2+ k ′+1 ) −3)=k −1+ k + 2+ k ′+12 ⋅ (k −1+ k + 2+ k ′+1) − 4 ⋅k ′+1⋅k +22+1≈2(А.22)k −1+ k +2+ k ′+11− =2 ⋅k ′+1⋅k +2  22 ⋅  (k −1+ k +2+ k ′+1) −k −1+ k + 2+ k ′+1 k ′+1⋅k +2(k −1+ k + 2+ k ′+1) 2 − 2 ⋅k ′+1⋅k +2(А.23)k ′+1⋅k +2.(k −1+ k + 2+ k ′+1) 2 − 2 ⋅k ′+1⋅k + 2Оценим выражениеk ′+1⋅k +2k ′+1⋅k +2= 2=222(k −1+ k +2+ k ′+1) − 2 ⋅k ′+1⋅k + 2 k−1 + k +2 + (k ′+1 ) + 2 ⋅k ′+1⋅k −1+2 ⋅ k+2 ⋅k −111===2k −1k +2 k ′+1 2 ⋅k −1 2 ⋅k −1  k +2 k ′+1  k −1  k −1 + 2 ⋅k ′+1++++ +⋅ + 2 +k ′+1⋅k +2 k ′+1 k + 2k +2k ′+1k +2 k ′+1 k +2  k ′+1 =1 k + 2 k ′ +1  k + 2 ⋅k ′ +1 + Kd1′ ⋅  −1++ 2 k +2 k ′ +1 k +2 .Согласно экспериментальным данным Kd1 > 1,5 ⋅ 10 −6 M (раздел 1.6.1, таблица 1.1),следовательно, Kd1′ > 0,15 31.Кроме того:а)k +2 k ′+1+≥ 2 (как сумма двух положительных взаимно обратных чисел)k ′+1 k +2б)k −1 + 2 ⋅k ′ +1> 0 32.k +2Исходя из этого:k ′ +1⋅k + 211=<= 0,43 .2(k −1+ k + 2+ k ′ +1) − 2 ⋅k ′ +1⋅k + 2  k +2 k ′ +1  k −1 + 2 ⋅k ′ +1 2 + 0,15 ⋅ (0 + 2) + Kd1′ ⋅ ++ 2 k +2 k ′ +1 k +2 31Согласно нашим данным значение Kd1 больше приведенного, по крайней мере, на порядок, а следовательно,рассматриваемое приближение работает еще лучше.32Максимальное значение этого выражения будет достигнуто при условии соблюдения квазиравновесногоприближения:k +2<<k ′ +1 , или k +2 <<k −1 , или k +2 < 10 ⋅ (k ′ +1+ k −1 ) .148Такаяоценказначениякоэффициентаk ′+1⋅k +2(k −1+ k + 2+ k ′+1) 2 − 2 ⋅k ′+1⋅k + 2позволяетвпервомприближении допустить его равным нулю.

И поэтому уравнение (А.19) трансформируется вуравнение (А.24):[ RcAMP ] ≈ [ RC ]0 − [ RC ]0 ⋅ e − a1tгде коэффициент a1 , в соответствии с (А.21), приближенно равен(А.24),k ′+1⋅k + 2.k −1+ k + 2+ k ′+1Таким образом, действительно одноэкспоненциальная модель, используемая авторамиработы, годится для определения константы скорости диссоциации RC комплекса как вотсутствие, так и в присутствии цАМФ. Однако в показателе экспоненты находится неконстанта скорости одной из протекающих реакций, а коэффициент a1 .

Найдем его связь сконстантой скорости k + 2 .a1 ≈k ′+1⋅k + 2k ′+11= k +2⋅= k + 2⋅<k + 2k −1 k +2k +2k −1+ k + 2+ k ′+11++1 + Kd1′ +k ′+1 k ′+1k ′+1(А.25)То есть, коэффициент a1 в показателе экспоненты всегда меньше константы k + 2 . Обобщив всеприведенные рассуждения, можно сделать вывод, что полученное в рассматриваемыхэкспериментальных работах значение константы скорости диссоциации RC комплекса вприсутствии лиганда ( a1 ) можно рассматривать в качестве грубого (заниженного) приближениязначения константы k + 2 . Учет экспериментально полученных значений констант a1 , Kd 4 , Kd 3и k −2 в принципе позволяет найти точное значение константы k + 2 . Однако ввиду большогоразброса этих экспериментальных данных, мы решили не вводить уточняющую поправку ииспользовать в качестве грубого приближения значения k + 2 среднее значение между всемиполученными в экспериментах значениями a1 (раздел 1.6.1).149ПРИЛОЖЕНИЕ ББ.1 RAC комплексБ.1.1.

Схема процессов и постановка задачиИз приведенной на рисунке Б.1 схемы вытекает важное соотношение междуравновесными константами Kd1, Kd2, Kd3 и Kd4, базирующееся на принципе независимостиизменения свободной энергии реакции от ее пути.Kd 3 ⋅ Kd 2 = Kd1 ⋅ Kd 4(Б.1)Используя это соотношение, а также квазистационарное приближение, можно вывестивыражения для названных равновесных констант и константы активации Какт. Эти выражения, всвою очередь, позволят упорядочить имеющиеся экспериментальные данные: беря за основумаксимально достоверные оценки, уточнить значения тех констант, измеренные значениякоторых представляются далекими от истины.Kd4RCRcAMPCRCKd3Kd1Kd2RCcAMPCK+6K+5CCSSK-5PR – регуляторная субъединица, С – каталитическая субъединица, RC – комплекс каталитической субъединицы срегуляторной, RcAMP – R-субъединица, в цАМФ-связывающем сайте которой находится цАМФ RCcAMP – такназываемый «тройной комплекс» – комплекс каталитической субъединицы с регуляторной, в цАМФ-связывающемсайте которой находится цАМФ.

О возможном строении тройного комплекса – в разделе Б.1.8. На схеме такжеуказаны равновесные константы отдельных процессов (Kd) или константы скоростей реакцийРисунок Б.1 – Схема активации ПКА, в состав регуляторной субъединицы которой входиттолько один рабочий цАМФ-связывающий домен150Б.1.2 Определение равновесных констант Kd1, Kd2, Kd3 и Kd4Kd 4 =[ R] ⋅ [C ],[ RC ]Kd 2 =[ RcAMP] ⋅ [C ],[ RCcAMP]Kd 3 =[ R] ⋅ [cAMP],[ RcAMP]Kd1 =[ RC ] ⋅ [cAMP].[ RCcAMP]Из выражений для констант следует:[ RC ] =[ R ] ⋅ [C ],Kd 4[ RCcAMP ] =[ RcAMP ] ⋅ [C ] [ R ] ⋅ [cAMP ] ⋅ [C ]=.Kd 2Kd 3 ⋅ Kd 2Тогда:[ RC ] + [ RCcAMP 1] = [ R ] ⋅ [ C ] ⋅  Kd+4[ cAMP ]Kd 3 ⋅ Kd 2(Б.2)Б.1.3. Уравнение Михаэлиса-Ментенd [CS ]= k+ 5 [C ][S ] − k− 5[CS ] − k+ 6 [CS ] ,dtd [CS ]=0dtТогда:k+ 5[C ][S ] = [CS ] ⋅ (k− 5 + k+ 6 )(Б.3)C другой стороны:[C ] = [C ]tot − [CS ] − ([ RC ] + [ RCcAMP ]) , где [C]tot – полная концентрация С-субъединиц 1[cAMP] [C ] = [C ]tot − [CS ] − [ R ] ⋅ [C ] ⋅ + Kd 4 Kd3 ⋅ Kd 2  1[cAMP]   = [C ]tot − [CS ][C ] ⋅ 1 + [ R] ⋅ + Kd 4 Kd 3 ⋅ Kd 2   1[cAMP]  , тогда:Обозначим X = 1 + [ R] ⋅ + Kd 4 Kd3 ⋅ Kd 2 [C ] =[C ]tot [CS ]−XX(Б.4)Подставим выражение (Б.4) в уравнение (Б.3):k+ 5[C ]tot[CS ][ S ] − k+ 5[ S ] = [CS ] ⋅ (k− 5 + k+ 6 )XXk+ 5k [S ][C ]tot[ S ] = [CS ] ⋅ (k− 5 + k+ 6 + + 5 )XXk+ 5[C ]tot [ S ] = [CS ] ⋅ ((k−5 + k+ 6 ) ⋅ X + k + 5 [ S ])[CS ] =k + 5 [C ]tot [ S ](k− 5 + k+ 6 ) ⋅ X + k + 5 [ S ]Разделим и числитель, и знаменатель на k+5 и введем стандартное обозначение константы151Михаэлиса K m =k− 5 + k+ 6, тогдаk+ 5[C ]tot [ S ]K m ⋅ X + [S ][CS ] =(Б.5)Если бы в системе отсутствовала R-субъединица, то:[CS ]1 =[C ]tot [ S ]K m + [S ]По условиям задачи скорость реакции в присутствии R-субъединицы должна равняться50% от скорости реакции в отсутствие субъединицы.

Скорость реакции в первом случае равнаk+ 6 [CS ] , а во втором k+ 6 [CS ]1 . То есть отношение[CS ]1должно равняться двум.[CS ]Km ⋅ X + [S ]=2K m + [S ]K m ⋅ X = 2 K m + [S ]X =2+[S ]Km(Б.6)Б.1.4. Определение концентраций [CS] и [C] в системеОпределим концентрацию [CS], исходя из выражений (Б.5) и (Б.6):1 [C ] [ S ][C ]tot [ S ][C ]tot [ S ]tot[CS ] === 2= 1 [CS ]12K m ⋅ X + [S ] 2K m + [S ] + [S ]K m + [S ](Б.7)Определим концентрацию [C], исходя из выражений (Б.4) и (Б.6):1 [C ] [ S ][C ]tot ⋅ (K m + [ S ]) − 1 [C ]tot [ S ][C ]tot [CS ][C ]tottot22[C ] =−=−==[S]XX[S ] [S ] 2+2 + ⋅ (K m + [ S ]) 2 + ⋅ (K m + [ S ])K m K m K m [S ]2+1[C ]tot ⋅ K m + [C ]tot [ S ]Km[C ]tot2== 1 K m ⋅ [C ]tot ⋅=1 ⋅22[S ][S ] [S ] 1+ 2 + ⋅ (K m + [ S ]) 2 + ⋅ (K m + [ S ])KmKm Km (Б.8)Б.1.5.

Установление соотношения между концентрациями отдельных компонентовсистемыВ соответствии с выражениями (Б.2) и (Б.6): 1[ cAMP ][ RC ] + [ RCcAMP ] = [ R ] ⋅ [ C ] ⋅ +Kd 3 ⋅ Kd 2 Kd 4 = [ C ] ⋅ ( X − 1 ) =152 [ S ]  1 [C ]tot == [C ] ⋅ 1 +⋅2[S ] Km 1+Km [S ]  1 =⋅ 1 +⋅ [C ]tot2 Km (Б.9)Так как изначально в системе были только RC комплексы, а свободных R- и С-субъединиц не было, то из выражения (Б.9) следует также, что:[CS ] + [C ] = 1 ⋅ [C ]tot2(Б.10)[ R] + [ RcAMP] = 1 ⋅ [C ]tot2(Б.11)Выражение (Б.10) легко проверить, так как концентрации [CS] и [C] уже определены.1 [C ] [ S ]1 [C ] [ S ]tot[C ]tottot[C ]tot ⋅ K m 121[CS ] + [C ] =+⋅= 2+1 ⋅=⋅ [C ]tot .222[S]K m + [S ]K m + [S ]Km + [S ]1+KmБ.1.6. Определение концентрации цАМФ ([cAMP])В соответствии с принятым в разделе Б.1.3 обозначением: 1[cAMP]  , тогда:X = 1 + [ R] ⋅ + Kd 4 Kd3 ⋅ Kd 2 [S ] [S ] X −1Kd 3 ⋅ Kd 2 ⋅ Kd 4Km ⋅[ R] === 1 +1[cAMP]1[cAMP]  K m  Kd 3 ⋅ Kd 2 + Kd 4 ⋅ [cAMP]++Kd 4 Kd 3 ⋅ Kd 2 Kd 4 Kd 3 ⋅ Kd 21+[ RcAMP] =[ R] ⋅ [cAMP]  [ S ] Kd 2 ⋅ Kd 4 ⋅ [cAMP] ⋅= 1 +Kd3 K m  Kd3 ⋅ Kd 2 + Kd 4 ⋅ [cAMP](Б.13)Но исходя из выражения (Б.11) [ R] + [ RcAMP] = 1 ⋅ [C ]tot , следовательно:2 [ S ]  Kd3 ⋅ Kd 2 ⋅ Kd 4 + Kd 2 ⋅ Kd 4 ⋅ [cAMP] 11 + ⋅=⋅ [C ]tot2KKd3 ⋅ Kd 2 + Kd 4 ⋅ [cAMP]m Kd 3 ⋅ Kd 2 ⋅ Kd 4 + Kd 2 ⋅ Kd 4 ⋅ [cAMP] 1 [C ]tot=⋅= [C ]2[S ]Kd 3 ⋅ Kd 2 + Kd 4 ⋅ [cAMP]1+KmKd 3 ⋅ Kd 2 ⋅ Kd 4 + Kd 2 ⋅ Kd 4 ⋅ [cAMP] = [C ] ⋅ Kd 3 ⋅ Kd 2 + [C ] ⋅ Kd 4 ⋅ [cAMP]Kd 2 ⋅ Kd 4 ⋅ [cAMP] − [C ] ⋅ Kd 4 ⋅ [cAMP] = [C ] ⋅ Kd 3 ⋅ Kd 2 − Kd 3 ⋅ Kd 2 ⋅ Kd 4[cAMP] =Kd 3 ⋅ Kd 2 ⋅ ([C ] − Kd 4 ) Kd1 ⋅ ([C ] − Kd 4 )=Kd 4 ⋅ ( Kd 2 − [C ])( Kd 2 − [C ])K акт = [cAMP] + [ RcAMP] + [ RCcAMP ](Б.14)(Б.15)(Б.12)153Б.1.7.

Характеристики

Список файлов диссертации