Диссертация (1145986), страница 36
Текст из файла (страница 36)
Определение концентраций [R], [RcAMP], [RC] и [RCcAMP] [S ] [S ] Kd 3 ⋅ Kd 2 ⋅ Kd 4 ⋅ ⋅[ R] = 1 += 1 + K m Kd 3 ⋅ Kd 2 + Kd 4 ⋅ [cAMP] K m 1 +[S ] [S ]Kd 4 ⋅= 1 += 1 +K m 1 + [ C ] − Kd 4KmKd 2 − [ C ]Kd 4Kd 4⋅ [cAMP]Kd 3 ⋅ Kd 2=Kd 4 ⋅= Kd 2 − Kd 4Kd 2 − [ C ] [ S ] Kd 4 ⋅ (Kd 2 − [C ]) ⋅= 1 +Kd 2 − Kd 4 Km (Б.16) [ S ] [ S ] Kd 4 ⋅ (Kd 2 − [C ]) − 1 + ⋅[ RcAMP] = 1 ⋅ [C ]tot − [ R] = [C ] ⋅ 1 +=2Kd 2 − Kd 4 Km Km [S ] Kd 4 ⋅ (Kd 2 − [C ]) [ S ] [C ] ⋅ Kd 2 − [C ] ⋅ Kd 4 − Kd 4 ⋅ Kd 2 + Kd 4 ⋅ [C ] ⋅ [C ] − = 1 +⋅= 1 +=Kd 2 − Kd 4 K m Kd 2 − Kd 4 Km [ S ] [C ] ⋅ Kd 2 − Kd 4 ⋅ Kd 2 [ S ] Kd 2 ⋅ ([C ] − Kd 4 ) ⋅ ⋅= 1 += 1 +−KKdKdKKd 2 − Kd 4m 24m [ RC ] =(Б.17)1 ⋅ [C ] ⋅ (Kd − [C ])2[ R] ⋅ [C ] [ S ] Kd 2 − [C ] 1 [C ]tottot ⋅= 1 +⋅⋅= 22[S]Kd 4Kd 2 − Kd 4 K m Kd 2 − Kd 41+Km1 ⋅ [C ] ⋅ (Kd − [C ])tot2[ RCcAMP] = 1 ⋅ [C ]tot − [ RC ] = 1 ⋅ [C ]tot − 2=22Kd − Kd241 ⋅ [C ] ⋅ Kd − 1 ⋅ [C ] ⋅ Kd − 1 ⋅ [C ] ⋅ Kd + 1 ⋅ [C ] ⋅ [C ]tot2tot4tot2tot222= 2=Kd 2 − Kd 41 ⋅ [C ] ⋅ ([C ] − Kd )4tot= 2Kd 2 − Kd 4(Б.18)Б.1.8.
Возможные варианты строения комплекса RCcAMP и физический смысл константKd1 и Kd2Экспериментальные данные [43, 72, 77, 78] однозначно свидетельствуют в пользусуществования и стабильности тройного комплекса RCcAMP. Тем не менее этот комплекс менеепрочен, чем RC, (таблица 1.1) и его диссоциации способствует добавление в систему субстрата(на диссоциацию RC комплекса субстрат не влияет). Исходя из этих данных, былопредположено [77, 78], что цАМФ, вызывая переход R-субъединицы из H- в В-конформацию,приводит к разрыву всех связей между R- и С-субъединицами, кроме взаимодействия,образованного псевдосубстратной последовательностью R-субъединицы и каталитическим154сайтом С-субъединицы.
Для последнего взаимодействия не существует аллостерического механизма разрыва, но наличие в системе высоких концентраций субстрата (S) должно по законудействующих масс привести к преобладанию комплекса CS над комплексом RCcAMP [42].Несмотря на то, что изложенная гипотеза кажется нам абсолютно логичной иправдоподобной, мы не можем не отметить, что она, видимо, в полной мере относится только ктройным комплексам RABCcAMP2, на которых она и была сформулирована и для которыххарактерны наивысшие значения константы диссоциации (Kd2) близкие к 0,25µM. КомплексыRABCcAMP и RACcAMP, исходя из экспериментальных данных (таблица 1.1), значительнопрочнее, а следовательно, при их образовании разрываются далеко не все связи между R- и Ссубъединицами. То есть, можно предположить, что существует два конечных вариантаструктуры комплекса RCcAMP: RHCcAMP и RBcAMP:C.
Первый гипотетически являетсярезультатом докинга цАМФ в комплекс RHC (R-субъединица находится в H-конформации), авторой, опять же гипотетически, результатом перехода R-субъединицы в составе первогокомплекса в В-конформацию. Между этими конечными вариантами можно допуститьмножество промежуточных, и какой из них реализуется в действительности, зависит только отстроения исходного RC комплекса.Рассмотрим некоторые варианты перехода RC комплекса в цАМФ-связанную форму споследующей диссоциацией на свободную С-субъединицу и комплекс RcAMP.Введем обозначения: ∆Ghb – ∆G перехода R-субъединицы из H- в B-конформацию (этотвклад можно не учитывать, так как согласно экспериментальным данным для А-домена RIαсубъединицы он приблизительно равен нулю [31]); ∆GIS – ∆G разрыва взаимодействия RсубъединицывB-конформациисС-субъединицей(взаимодействия,образованногопсевдосубстратной последовательностью R-субъединицы и каталитическим сайтом Ссубъединицы); ∆GCh – ∆G разрыва взаимодействия R-субъединицы в H-конформации с Ссубъединицей за вычетом ∆GIS (со стороны R-субъединицы данное взаимодействиеопосредуется в основном С-спиралью); ∆GH – ∆G связывания цАМФ с сайтом в Hконформации; ∆GHB – ∆G связывания цАМФ с сайтом в B-конформации за вычетом ∆GH.Вариант 1: ∆GCh = 0 (рисунок Б.2 А)RHC комплекс не существует, так как переходит в RBC комплекс даже в отсутствиецАМФ.
При связывании цАМФ образуется RBcAMP:C комплекс, при этом константы Kd1, Kd2 иKd4 определяются по формулам:Kd1 = exp{(∆GH + ∆GHB ) / RT }Kd 2 = exp{− (∆GIS ) / RT }Kd 4 = exp{− (∆GIS ) / RT }155Следует отметить, что этот вариант вряд ли применим к известным комплексам (как дикоготипа, так и мутантным), так как в случае его реализации Kd4 = Kd2. Равенство этих констант, вопервых, противоречит экспериментальным данным (таблица 1.1), а во-вторых, делаетневозможным ускорение процесса диссоциации R- и С-субъединиц при помощи цАМФ.Вариант 2: ∆GCh < ∆GHB (рисунок Б.2 Б)При связывании цАМФ образуется RBcAMP:C комплекс, однако возможно, что егообразование идет в две стадии: через комплекс RHCcAMP, который является результатомдокинга цАМФ в связывающий сайт домена в Н-конформации.
Существование промежуточного(RHCcAMP) комплекса экспериментально не показано, следовательно, даже если онреализуется, то время его жизни должно быть очень мало. Таким образом, Kd1, Kd2 и Kd4определяются по формулам:Kd1 = exp{(∆GH + ∆GHB + ∆GCh ) / RT }Kd 2 = exp{− (∆GIS ) / RT }Kd 4 = exp{− (∆GIS + ∆GCh ) / RT }Вариант 3: ∆GCh = ∆GHB (рисунок Б.2 В)При связывании цАМФ образуется комплекс RHCcAMP, который находится в равновесиис комплексом RBcAMP:C. Kd1, Kd2 и Kd4 определяются по формулам:Kd1 = exp{(∆GH / RT }Kd 2 = exp{− (∆GIS ) / RT }Kd 4 = exp{− (∆GIS + ∆GCh ) / RT }Вариант 4: ∆GCh > ∆GHB (рисунок Б.2 Г)При связывании цАМФ образуется комплекс RHCcAMP, который по термодинамическимпричинам не может переходить в комплекс RBcAMP:C.Kd1, Kd2 и Kd4 определяются по формулам:Kd1 = exp{(∆GH / RT }Kd 2 = exp{− (∆GIS + ∆GCh + ∆GHB ) / RT }Kd 4 = exp{− (∆GIS + ∆GCh ) / RT }Таким образом:1) минимальное значение Kd1 наблюдается варианте 1 Kd1 = exp{(∆GH + ∆GHB ) / RT }, амаксимальное – в вариантах 3 и 4 Kd1 = exp{∆GH / RT }1562) минимальное значение Kd2 наблюдается в варианте 4Kd 2 = exp{− (∆GIS + ∆GCh + ∆GHB ) / RT }, а максимальное – в вариантах 1, 2, 3Kd 2 = exp{− (∆GIS ) / RT }минимальное значение Kd4 наблюдается в варианте 4 Kd 4 = exp{− (∆GIS + ∆GCh ) / RT }, амаксимальное в варианте 1 Kd 4 = exp{− (∆GIS ) / RT }RB+C+cAMPА.RB+C+cAMPБ.∆GH∆GIS∆GH∆GIS+∆GCh∆GHBRBC+cAMPRBcAMP+C∆GH∆GIS∆GHB∆GH∆GHBRBcAMP:CRBcAMP+CRHC+cAMP∆GISRHCcAMPRBcAMP:C∆GHB∆GChВ.Г.RB+C+cAMPRB+C+cAMP∆GH∆GIS+∆GCh∆GH∆GHB∆GIS+∆GChRBcAMP+CRBcAMP+C∆GISRHC+cAMP∆GH∆GISRHC+cAMPRHCcAMPRBcAMP:C∆GCh∆GHB∆GHRBcAMP:CRHCcAMP∆GHBА–∆GHB∆GCh∆GCh = 0 ; Б – ∆GCh < ∆GHB ; В – ∆GCh = ∆GHB ; Г – ∆GCh > ∆GHBСиними стрелками обозначены вклады ∆G, отвечающие за значение Kd1, а красными – за значение Kd2Рисунок Б.2 – Варианты перехода RC комплекса в зависимости от его строения в цАМФсвязанную форму с последующей диссоциацией на свободную С-субъединицу и комплексRcAMP157Б.1.9.
Количественная оценка констант Kd1, Kd2, Kd3 и Kd4В экспериментальных работах исследовано по крайней мере шесть RC комплексов,поведение которых при связывании цАМФ описывается схемой, приведенной в разделе Б.1.1:RAC WT, RAC R226A, RAC L233A, RAC M234A, RABC R333K и RABC R209K.Комплексы RAC R226A и RAC L233A мало отличаются от комплекса RAC M234A [32], апотому не представляют большого интереса для количественной оценки констант.
Рассмотримостальные комплексы.Б.1.9.1. Комплекс RAC WTИз экспериментальных данных (таблица 1.1) следует, что значение Kd2 комплекса RACWT в любом случае не превышает 2,5·10-7M, то есть предельного значения Kd2,характеризующего взаимодействие между R- и С-субъединицами в RABC WT комплексе, обасайта которого заняты молекулами цАМФ. Как уже отмечалось выше, в этом взаимодействии,вероятно,участвуюттолькопсевдосубстратнаяпоследовательностьR-субъединицыикаталитический сайт С-субъединицы, и более слабого комплекса R- и С-субъединицыобразовывать не могут. Таким образом, используя терминологию рисунка Б.2, можно сказать,что активация комплекса RAC WT идет по пути, описанному в «Варианте 4». Примем, что намизданных,приведенныхвтаблице1.1,известнызначенияKd 4 = 2,0 ⋅10 −10 MиKd 3 = 1,2 ⋅ 10 −7 M .
Выбранное значение Kd3 отвечает не только экспериментальным данным, нои сопоставимо с нашими результатами, полученными методом докинга (раздел 3.1.1)33.Наиболее неоднозначной и спорной представляется оценка значения Kd2. Тем не менееосновываясь на экспериментальных данных (таблица 1.1) и рассуждениях, приведенных вприложении А, мы приняли в качестве первого грубого приближения значения Kd2 6,7·10-8M.Оценим значения Kd1 и [cAMP] для комплекса RAC WT. Исходя из (Б.14), [cAMP]определяется выражением:[cAMP ] =Kd 3 ⋅ Kd 2 ⋅ ([C ] − Kd 4 ) Kd 3 ⋅ [C ] − Kd 3⋅Kd 4=[C ]Kd 4 ⋅ ( Kd 2 − [C ])Kd 4 − Kd 4 ⋅Kd 2Чем больше значение Kd2, тем меньше концентрация цАМФ, необходимая для активацииПКА Iα наполовину. Если Kd 2 = 2,5 ⋅10 −7 M , то есть максимальному своему значению,приближенную минимальную концентрацию цАМФ ([cAMP]min) для известных значений Kd3 иKd4 можно определить по формуле (Б.19).33Значению Kd 3 = 1,2 ⋅ 10 −7 M соответствует изменение свободной энергии ∆G300, равное -39,5 кДж/моль.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
