Диссертация (1145986), страница 38
Текст из файла (страница 38)
А)Kd31,2·10-7Эксперимент (таблица 1.1)Kd42,0·10-10Эксперимент (таблица 1.1)Kакт/[C]tot9,5·10-7/2,5·10-8Оценена в разделе Б.1.9.1RAC M234AKd12,1·10-5Оценена в разделе Б.1.9.2Kd22,5·10-7Оценена в разделе Б.1.9.2Kd31,2·10-7Эксперимент (таблица 1.1)Kd41,42·10-9Kакт/[C]tot-8Оценена в разделе Б.1.9.22,8·10 /2,5·10-8Эксперимент (таблица 1.2)RABC R333KKd14,0·10-5Оценена в разделе Б.1.9.1Kd23,1·10-8Оценена в разделе Б.1.9.3Kd37,8·10-8Оценена в разделе Б.1.9.3Kd46,0·10-11Эксперимент (таблица 1.1)Kакт/[C]tot1,8·10-6/2,0·10-8Эксперимент (таблица 1.2)RABC R209KKd16,0·10-7Эксперимент (таблица 1.1)Kd21,86·10-9Оценена в разделе Б.1.9.4-8Оценена в разделе Б.1.9.4Kd31,3·10Kd44,0·10-11Эксперимент (таблица 1.1)Kакт/[C]tot1,7·10-6/2,0·10-8Эксперимент (таблица 1.2)Б.2. RABC комплексБ.2.1.
Схема процессов и постановка задачиДля проверки оценки, сделанной в предыдущем разделе, нами была также построенамодель активации RC комплекса, в состав которого входит R-субъединица, не несущая мутаций,а следовательно, связывающая две молекулы цАМФ. Схема процессов, лежащих в основе этоймодели, показана на рисунке (рисунок Б.3).164Из приведенной схемы вытекает ряд важных соотношений между равновеснымиконстантами, базирующихся на принципе независимости изменения свободной энергии реакцииот ее пути.Kd 4 ⋅ Kd1 A = Kd 3 A ⋅ Kd 2 A(Б.29)Kd 2 A ⋅ Kd1AB = Kd 3AB ⋅ Kd 2(Б.30)Kd 4 ⋅ Kd1B = Kd 3 B ⋅ Kd 2 B(Б.31)Kd 2 B ⋅ Kd1BA = Kd 3BA ⋅ Kd 2(Б.32)Kd1 A ⋅ Kd1AB = Kd1B ⋅ Kd1BA(Б.33)Kd 3 A ⋅ Kd 3AB = Kd 3 B ⋅ Kd 3BA(Б.34)Так как с RABC комплексом и R-субъединицей дикого типа связывается по две молекулыцАМФ, то теоретически представляется возможным рассчитать значения средних констант2связывания цАМФ с этими системами ( Kd RCи Kd R2 ).
Они определяются формулами:2Kd RC=[ RС ] ⋅ [cAMP]2[ RCcAMP2 ]Kd R2 =[ R ] ⋅ [cAMP]2[ RcAMP2 ]При этом для этих констант будут справедливы равенства, вытекающие из принципанезависимости изменения свободной энергии реакции от ее пути:2Kd1 A ⋅ Kd1AB = Kd1B ⋅ Kd1BA = Kd RC(Б.35)Kd 3 A ⋅ Kd 3AB = Kd 3 B ⋅ Kd 3BA = Kd R2(Б.36)Насколькоможнопонятьизописанийпроведенияэкспериментов,авторыэкспериментальных работ, если не упоминают, связывание с каким из доменов они изучают,пытаются измерить квадратные корни из этих констант. Нам представляется, что такиеизмерения достаточно сложно провести корректно, если в принципе возможно, потому чтоконцентрация в системе комплексов RcAMPA, RcAMPB, RСcAMPA и RСcAMPB отнюдь нестремится к нулю.
Реально, на наш взгляд, получается найти такую концентрацию цАМФ, прикоторой половина из всех существующих цАМФ-связывающих сайтов занята лигандом, но приэтом нельзя сказать, что половина всех RC комплексов находится в состоянии RСcAMP2, или жеполовина всех R-субъединиц находится в состоянии RcAMP2. Поэтому полученные в ходеэкспериментальных измерений оценки квадратных корней из данных констант нампредставляются весьма приблизительными, и опираться на них в расчетах мы не будем. Однакоосновываясь на соотношениях (Б.35) и (Б.36), мы попытаемся оценить истинные значения2Kd RC = Kd RCи Kd R = Kd R2 и сравним их с имеющимися экспериментальными данными.165Kd4CKd4Kd1AKd3AKd1BKd3BKd2ACRcAMPAKd2BKdA1BKdB1AKd2CRcAMP2CRcAMPBRCcAMPBRCcAMPAKdA3BCRRCRKdB3AKd2RCcAMP2RcAMP2CR – регуляторная субъединица; С – каталитическая субъединица; RC – комплекс каталитической субъединицы с регуляторной; RCcAMPA – комплекс каталитическойсубъединицы с регуляторной, в цАМФ-связывающем сайте А-домена которой находится цАМФ; RCcAMPB – комплекс каталитической субъединицы с регуляторной, вцАМФ-связывающем сайте В-домена которой находится цАМФ; RCcAMP2 – комплекс каталитической субъединицы с регуляторной, в обоих цАМФ-связывающихсайтах которой находится цАМФ; RcAMPA – R-субъединица, в цАМФ-связывающем сайте А-домена которой находится цАМФ; RcAMPB – R-субъединица, в цАМФсвязывающем сайте B-домена которой находится цАМФ; RcAMP2 – R-субъединица, в обоих цАМФ-связывающих сайтах которой находится цАМФ.
На схеме такжеуказаны равновесные константы отдельных процессов Kd (пояснения в тексте)Рисунок Б.3 – Схема активации ПКА, в состав регуляторной субъединицы которой входят два доступных для лигандацАМФ-связывающих домена166Б.2.2 Вывод соотношений для оценки равновесных константВоспользуемся соотношениями (Б.9) – (Б.11). Тогда:[ R] + [ RcAMPA ] + [ RcAMPB ] + [ RcAMP2 ] = 1 ⋅ [C ]tot2(Б.37)[ R] + [ RCcAMPA ] + [ RCcAMPB ] + [ RCcAMP2 ] = 1 ⋅ [C ]tot2(Б.38)Запишем выражения для некоторых из равновесных констант:Kd 3 A =[ R] ⋅ [cAMP][ R ] ⋅ [cAMP]⇒ [ RcAMPA ] =[ RcAMPA ]Kd 3 AKd 3 B =[ R ] ⋅ [cAMP][ R ] ⋅ [cAMP]⇒ [ RcAMPB ] =[ RcAMPB ]Kd 3 BKd 3BA =[ RcAMPB ] ⋅ [cAMP][ RcAMPB ] ⋅ [cAMP] [ R] ⋅ [cAMP]2⇒ [ RcAMP2 ] ==[ RcAMP2 ]Kd 3BAKd 3BA ⋅ Kd 3 BKd 4 =[ R ] ⋅ [C ][ R ] ⋅ [C ]⇒ [ RC ] =[ RC ]Kd 4Kd1 A =[ RC ] ⋅ [cAMP][ RC ] ⋅ [cAMP] [ R ] ⋅ [C ] ⋅ [cAMP]⇒ [ RCcAMPA ] ==[ RCcAMPA ]Kd1 AKd 4 ⋅ Kd1 AKd1B =[ RC ] ⋅ [cAMP][ RC ] ⋅ [cAMP] [ R] ⋅ [C ] ⋅ [cAMP]⇒ [ RCcAMPB ] ==[ RCcAMPB ]Kd1BKd 4 ⋅ Kd1BKd 2 =[ RcAMP2 ] ⋅ [C ][ RcAMP2 ] ⋅ [C ] [ R ] ⋅ [C ] ⋅ [cAMP]2⇒ [ RCcAMP2 ] ==[ RCcAMP2 ]Kd 2Kd 2 ⋅ Kd 3 B ⋅ Kd 3BAПодставим приведенные выражения в соотношения (Б.37) и (Б.38): [cAMP] [cAMP][cAMP]2 1[ R] ⋅ 1 +++ = 2 ⋅ [C ]totKd3 AKd 3 BKd 3 B ⋅ Kd3BA 1 1[cAMP][cAMP][cAMP]2[ R] ⋅ [C ] ⋅ +++=⋅ [C ]totB 2KdKd⋅KdKd⋅KdKd⋅Kd⋅Kd44141233ABBA(Б.39)(Б.40)Приравняем выражения (Б.39) и (Б.40), поделим обе части равенства на [R] и домножимна ( Kd 2 ⋅ Kd 4 ⋅ Kd 1 A⋅Kd 1B⋅Kd 3 A ⋅ Kd 3 B ⋅ Kd 3BA ):Левая часть равенства:Kd 2 ⋅ Kd 4 ⋅ Kd 1 A⋅Kd 1B⋅Kd3 A ⋅ Kd3 B ⋅ Kd 3BA + [cAMP] ⋅ Kd 2 ⋅ Kd 4 ⋅ Kd 1 A⋅Kd 1B⋅Kd3 B ⋅ Kd3BA ++ [cAMP] ⋅ Kd 2 ⋅ Kd 4 ⋅ Kd 1 A⋅Kd 1B⋅Kd3 A ⋅ Kd3BA + [cAMP]2 ⋅ Kd 2 ⋅ Kd 4 ⋅ Kd 1 A⋅Kd 1B⋅Kd3 AПравая часть равенства:[C ] ⋅ Kd 2 ⋅ Kd 1 A⋅Kd 1B⋅Kd3 A ⋅ Kd3 B ⋅ Kd3BA + [cAMP] ⋅ [C ] ⋅ Kd 2 ⋅ Kd 1B⋅Kd3 A ⋅ Kd3 B ⋅ Kd3BA ++ [cAMP] ⋅ [C ] ⋅ Kd 2 ⋅ Kd 1 A⋅Kd3 A ⋅ Kd 3 B ⋅ Kd3BA + [cAMP]2 ⋅ [C ] ⋅ Kd 4 ⋅ Kd 1 A⋅Kd 1B⋅Kd3 A167Перегруппируем члены и запишем квадратное уравнение относительно [cAMP]:a ⋅ [cAMP]2 + b ⋅ [cAMP] + c = 0a = Kd 4 ⋅ Kd 1 A⋅Kd 1B⋅Kd 3 A ⋅ ( Kd 2 − [C ])b = Kd 2 ⋅ Kd 4 ⋅ Kd 1 A⋅Kd 1B⋅Kd 3BA ⋅ ( Kd 3 B + Kd 3 A ) − [C ] ⋅ Kd 2 ⋅ Kd 3 A ⋅ Kd 3 B ⋅ Kd 3BA ⋅ ( Kd 1B+ Kd1 A )c = Kd 2 ⋅ Kd 1 A⋅Kd 1B⋅Kd 3 A ⋅ Kd 3 B ⋅ Kd 3BA ⋅ ( Kd 4 − [C ])Решение квадратного уравнения:D = b2 − 4 ⋅ a ⋅ c[cAMP] =−b± D2⋅a(Б.41)Б.2.3.
Определение концентрации компонентов системыКонцентрации [CS] и [C] определяются в соответствии с соотношениями (Б.7) и (Б.8).Исходя из (Б.39), можно определить концентрацию свободной R-субъединицы:1 ⋅ [C ]tot2[ R] =[cAMP] [cAMP][cAMP]21+++Kd3 AKd3 BKd3 B ⋅ Kd3BAКонцентрации остальных компонентов смеси равны:[ RcAMPA ] =[ R ] ⋅ [cAMP]Kd 3 A[ RcAMPB ] =[ R ] ⋅ [cAMP]Kd 3 B[ RcAMP2 ] =[ R ] ⋅ [cAMP]2Kd 3BA ⋅ Kd 3 B[ RC ] =[ R ] ⋅ [C ]Kd 4[ RCcAMPA ] =[ R ] ⋅ [C ] ⋅ [cAMP ]Kd 4 ⋅ Kd1 A[ RCcAMPB ] =[ R ] ⋅ [C ] ⋅ [cAMP]Kd 4 ⋅ Kd1B[ RCcAMP2 ] =[ R ] ⋅ [C ] ⋅ [cAMP ]2Kd 2 ⋅ Kd 3 B ⋅ Kd 3BAБ.2.4. Количественная оценка равновесных констант и KактВоспользуемсяоценками,полученнымивразделеБ.1.9,ипримем:168Kd1A = 4,0·10-5 М, Kd3A = 7,8·10-8 М, Kd3B = 1,3·10-8 М.
Также, учитывая экспериментальныеданные (таблица 1.1), примем: Kd2 = 2,5·10-7 М (предельное значение Kd2, характеризующее, повсей видимости, взаимодействие между R- и С-субъединицами только за счет каталитическогосайта и псевдосубстратной последовательности, и характерное для RABC WT комплекса),Kd1B = 6,0·10-7 М и Kd 3BA = 5,6 ⋅ 10 −8 М .Значение [cAMP] определим по формуле (Б.41). Значения остальных равновесныхконстант установим, используя приведенные в предыдущем абзаце экспериментальные данныеи соотношения (Б.29) – (Б.34).
Рассчитав концентрации компонентов системы, как указано вразделе Б.2.3, получим численную оценку Kакт.Исходя из данных, приведенных в таблице 1.1, среднее значение Kd4 составляет1,45·10-10 М. Однако решение задачи с этим значением приводит к неудовлетворительнымрезультатам: значение Kd2A оказывается несколько больше значения Kd2 для RAC WTкомплекса, что невозможно, так как комплекс RABC WT хоть незначительно, но крепчекомплекса RAC WT. В то же время взятое нами среднее значение Kd4 получено всего на двухизмерениях (1,0·10-10 М и 1,9·10-10 М) и поэтому его достоверность можно поставить подсомнение.
В этой связи вполне приемлемым представляется использование вместо конкретногосреднего значения Kd4 диапазона, определяемого данными двух предпринятых измерений, ивариация значения Kd4 в рамках этого диапазона. Целью вариации является определениемаксимального значения Kd4, при котором значения других констант не противоречат другдругу.В таблице Б.2 суммированы все полученные оценки.1) Kd 4 = 1,25 ⋅10 −10 М . При всех ранее принятых оценках, такое значение Kd4 являетсямаксимальным, при котором значение Kd2A оказывается меньше значения Kd2 для RAC WT.2) Kакт = 9,8·10-8 М, при условиях что [C]tot = 2,5·10-8 М, [S] = 1,0·10-4М, Km = 1,6·10-5М.
Такаяоценка хорошо согласуется с экспериментальными данными (таблица 1.2).3) Kd1BA = 2,4 ⋅10 −6 М . Экспериментальных оценок этой константы не существует, но данноезначение представляется правдоподобным, так как выполняется неравенство Kd1BA < Kd1 A .Этонеравенствоотражаетэкспериментальнообнаруженную[72]положительнуюкооперативность между А- и В-сайтами в RABC WT комплексе.4) Kd1AB = 3,5 ⋅10 −8 М . Экспериментальных оценок этой константы, не существует, нополученное значение представляется правдоподобным, так как выполняется неравенствоKd1AB < Kd1B .Этонеравенствоотражаетэкспериментальнообнаруженнуюположительную кооперативность между А- и В-сайтами в RABC WT комплексе.[72]1695) Kd 3AB = 9,2 ⋅ 10 −9 М .
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
