Диссертация (1145986), страница 37
Текст из файла (страница 37)
Исходяже из наших расчетов, ∆G300 = -38,7±5,8 кДж/моль, а соответствующее значение Kd3 равняется 1,8·10-7М.158[cAMP ]min =Kd 3 ⋅ [C ] − Kd 3⋅Kd 4 Kd 3 ⋅ [C ]≈− Kd 3[C ]Kd4Kd 4 − Kd 4 ⋅Kd 2(Б.19)Максимальная концентрация цАМФ, достигаемая при Kd 2 → [C ] , как видно извыражения Б.14, стремится к бесконечности.Значение Kd1, при условии того, что известны значения Kd2, Kd3 и Kd4, однозначноопределяется по формуле (Б.1).Kd1 =Kd 3 ⋅ Kd 2Kd 4Исходя из численных приближений, принятых в данном разделе, получены следующиезначения Kd1 и Kакт:1) Kd1 = 4,0·10-5M, причем это значение константы, ввиду активации комплекса RAC WTпо пути «Вариант 4», характеризует связывание цАМФ с А-доменом, находящимся в Hконформации в составе RC комплекса. Такая оценка константы довольно сильноотличается от имеющихся экспериментальных данных (таблица 1.1), однако в обзорелитературы нами указывались причины, по которым эти экспериментальные данныеможно поставить под сомнение (раздел 1.6.2.2).
В то же время различия междуоцененным значением константы и полученным в ходе докинга не столь явственны.Значениюконстанты4,0·10-5Mсоответствуетизменениесвободнойэнергии∆G300 = -25,3 кДж/моль, а в ходе докинга получено значение ∆G304 (≈∆G300) равное-24,6±3,7 кДж/моль, чему соответствует Kd1 ≈ 5,2·10-5М.2) Значение константы активации (Kакт) оценено как 9,5·10-7М, при условиях что [C]tot =2,5·10-8 М, [S] = 1,0·10-4М, Km = 1,6·10-5М. Такая оценка вполне согласуется сэкспериментальными данными (таблица 1.2).Все полученные оценки суммированы в таблице Б.1Б.1.9.2.
Комплекс RAC M234AКомплексы RAC WT и RAC M234A, очевидно, различаются только значением ∆GCh, чтопозволяет при оценке значений констант рассматривать их в совокупности. Судя по значениямKd4 (таблица 1.1), комплекс RAC WT крепче комплекса RAC M234A, то есть для комплексаRAC WT характерно большее значение ∆GCh. Активация комплекса RAC WT идет по пути,описанному в «Варианте 4». Следовательно, активация комплекса RAC M234A может идти попутям «Вариант 2», «Вариант 3» или «Вариант 4». (Путь «Вариант 1» не рассматривается попричинам, изложенным в разделе Б.1.8.).Примем, что нам из данных, приведенных в таблицах 1.1 и 1.2, известны значения159Kd 3 = 1,2 ⋅ 10 −7 M (значения Kd3 для комплексов RAC WT и RAC M234A равны друг другу) иK акт = 2,8 ⋅ 10−8 M .Решение 1.Найдем значения констант, характеризующих активацию комплекса RAC M234A попутям «Вариант 4» или «Вариант 3».
При этом на систему накладываются дополнительныеусловия: значения Kd1 для комплексов RAC WT и RAC M234A равны друг другу, аKd 2 ≤ 2,5 ⋅10 −7 M .Принимая за значение Kd1 соответствующее значение, определенное в разделе Б.1.9.1,запишем соотношение (Б.14) в виде:[cAMP ] =Kd 3 ⋅ Kd 2 ⋅ ([C ] − Kd 4 )[C ] − Kd 4= Kd1 ⋅Kd 4 ⋅ ( Kd 2 − [C ])Kd 2 − [C ](Б.20)В соответствии с формулой (Б.1):Kd 2 =Kd1 ⋅ Kd 4Kd 3(Б.21)Подставим (Б.21) в (Б.20) и выразим Kd4.[cAMP ] = Kd1 ⋅[C ] − Kd 4[C ] − Kd 4= Kd1 ⋅ Kd 3Kd1 ⋅ Kd 4Kd1 ⋅ Kd 4 − Kd 3 ⋅ [C ]− [C ]Kd 3[cAMP ] ⋅ Kd1 ⋅ Kd 4 − [cAMP ] ⋅ Kd 3 ⋅ [C ] = Kd1 ⋅ Kd 3 ⋅ [C ] − Kd1 ⋅ Kd 3 ⋅ Kd 4[cAMP ] ⋅ Kd1 ⋅ Kd 4 + Kd1 ⋅ Kd 3 ⋅ Kd 4 = Kd1 ⋅ Kd 3 ⋅ [C ] + [cAMP ] ⋅ Kd 3 ⋅ [C ]Kd 4 =Kd 3 ⋅ [C ] ⋅ ( Kd1 + [cAMP ])Kd 3 ⋅ [C ]Kd 3 ⋅ [C ][cAMP ]=+⋅Kd1 ⋅ ([cAMP ] + Kd3 )[cAMP ] + Kd 3 [cAMP ] + Kd 3Kd1(Б.22)Определим значение Kd2 по формуле (Б.21) и проверим выполнение соотношенияKd 2 ≤ 2,5 ⋅10 −7 M .
Если Kd2 > 2,5·10-7M, в рамках решения 1 не существует значений констант,удовлетворяющих всем заданным условиям, и следует переходить к решению 2.Решение 2.Найдем значения констант, характеризующих активацию комплекса RAC M234A по пути«Вариант 2». При этом на систему накладывается условие: Kd 2 = 2,5 ⋅ 10 −7 M .В соответствии с выражением (Б.14):[cAMP ] =Kd 3 ⋅ Kd 2 ⋅ ([C ] − Kd 4 )Kd 4 ⋅ ( Kd 2 − [C ])Выразим Kd4:[cAMP ] ⋅ Kd 4 ⋅ ( Kd 2 − [C ]) = Kd 3 ⋅ Kd 2 ⋅ ([C ] − Kd 4 )[cAMP ] ⋅ Kd 4 ⋅ ( Kd 2 − [C ]) + Kd 3 ⋅ Kd 2 ⋅ Kd 4 = Kd 3 ⋅ Kd 2 ⋅ [C ]160Kd 4 ⋅ ([cAMP ] ⋅ Kd 2 − [cAMP ] ⋅ [C ] + Kd 3 ⋅ Kd 2 ) = Kd 3 ⋅ Kd 2 ⋅ [C ]Kd 3 ⋅ Kd 2 ⋅ [C ]Kd 4 =[cAMP ] ⋅ Kd 2 − [cAMP ] ⋅ [C ] + Kd 3 ⋅ Kd 2Kd 3 ⋅ [C ]Kd 4 =(Б.23)[cAMP ] ⋅ [C ][cAMP ] + Kd 3 −Kd 2Значение Kd1 определяется в соответствии с выражением (Б.1):Kd1 =Kd 2 ⋅ Kd 3Kd 4Сложность решения этой задачи состоит в том, что нам не известно значение [cAMP], атолькозначениесвязанноеKакт,с[cAMP]соотношением(Б.15):K акт = [cAMP] + [ RcAMP] + [ RCcAMP] .
Однако численно, итеративным путем, можно подобратьтакое значение [cAMP], при котором значение Kакт совпадает с полученным в эксперименте.В результате, с учетом экспериментальных данных и наших оценок активации комплексаRAC WT, имеем (см. таблица Б.1):1) активация комплекса RAC M234A проходит по пути «Вариант 2».
Kd2 при этомпринимает максимальное возможное значение 2,5·10-7M.2) Kd4 = 1,4·10-9M, что несколько превышает значение, полученное экспериментально(1,1·10-9M).3) Kd1 = 2,1·10-5M, причем это значение константы, ввиду активации комплекса по пути«Вариант 2», меньше константы докинга цАМФ в цАМФ-связывающий сайт А-домена,находящегося в H-конформации.Б.1.9.3.
Комплекс RABC R333KИсходя из всех имеющихся экспериментальных данных (таблица 1.1) Kd2 комплексаRABC R333K много меньше критического значения 2,5·10-7M, а следовательно, этот комплексактивируется по пути «Вариант 4». В таком случае значения Kd1 для комплексов RABC R333K иRAC WT должны совпадать и в соответствии с полученными выше оценками составлять4,0·10-5M. Примем также, что нам из эксперимента известно значение Kd4 и Kакт:Kd 4 = 6,0 ⋅10 −11 M , K акт = 1,8 ⋅ 10 −6 M .Запишем выражение для Kd2.C одной стороныKd 3 =Kd1 ⋅ Kd 4Kd 2С другой стороны, преобразуя выражение (Б.14), имеем:(Б.24)161 Kd 41Kd 4 ⋅ [C ] Kd 3= [cAMP ] ⋅ −⋅[C ] − Kd 4 Kd 2 ([C ] − Kd 4 ) (Б.25)Приравняем выражения (Б.24) и (Б.25):Kd 4 ⋅ [cAMP ] [cAMP ] Kd 4 ⋅ [C ]Kd1 ⋅ Kd 4−⋅=[C ] − Kd 4Kd 2([C ] − Kd 4 )Kd 2Kd 2 ⋅Kd 4 ⋅ [cAMP ]Kd 4 ⋅ [C ]= Kd1 ⋅ Kd 4− [cAMP ] ⋅[C ] − Kd 4([C ] − Kd 4 )Kd 2 ⋅Kd 4 ⋅ [cAMP ]Kd 4 ⋅ [C ]= Kd1 ⋅ Kd 4 + [cAMP ] ⋅[C ] − Kd 4([C ] − Kd 4 )Kd 2 =Kd1 ⋅ ([C ] − Kd 4 )+ [C ][cAMP ]Kd 3 =Kd1 ⋅ Kd 4Kd1 ⋅ Kd 4 ⋅ [cAMP]=Kd 2Kd1 ⋅ ([C ] − Kd 4 ) + [C ] ⋅ [cAMP](Б.26)(Б.27)Перед тем как оценить численные значения констант, проверим, согласуются ли междусобой значения Kd1, Kd4 и [cAMP].Вариация [cAMP] демонстрирует, что с увеличением [cAMP] значение Kd2 уменьшается,а Kd3, напротив, увеличивается, но до некоторого предела.
Предельное значение Kd3 ( Kd 3 lim )можно оценить, исходя из соотношения (Б.27). Если [cAMP]→+∞, то Kd 3 → Kd 3 lim =Kd1 ⋅ Kd 4.[C ]С другой стороны, очевидно, что значение Kd3 для комплекса RABC R333K должно быть меньшеили равно соответствующему значению для комплекса RAC WT. Такое соотношение должновыполняться, потому как в комплексе RABC R333K присутствует остаток W260, кэпирующийлиганд. Возможно, что этот остаток и не формирует с лигандом такое сильное взаимодействие,как в комплексе RABC.
Ведь для сильного взаимодействия нужна правильная ориентацияароматического кольца W260, а ей способствует присутствие лиганда в цАМФ-связывающемсайте B-домена. Однако даже если взаимодействие между ароматическими кольцами нереализуется, лиганд все равно не будет связываться А-сайтом RABC R333K комплекса слабее,чем А-сайтом RAC комплекса. Поэтому, если обозначить Kd 3 max = K ′d 3 (где K ′d 3 – значениеконстанты для RAC WT комплекса) и допустить, что Kd 3 max < Kd 3 lim , на [cAMP] нужно наложитьдополнительное условие:[cAMP] < [cAMP]max , где [cAMP]max – концентрация цАМФ,соответствующая Kd3max.Найдем [cAMP]max.Kd 3 max =Kd1 ⋅ Kd 4 ⋅ [cAMP]maxKd1 ⋅ ([C ] − Kd 4 ) + [C ] ⋅ [cAMP]max162Kd 3 max ⋅ Kd1 ⋅ ([C ] − Kd 4 ) + Kd 3 max ⋅ [C ] ⋅ [cAMP]max = Kd1 ⋅ Kd 4 ⋅ [cAMP]maxKd 3 max ⋅ Kd1 ⋅ ([C ] − Kd 4 ) = Kd1 ⋅ Kd 4 ⋅ [cAMP]max − Kd 3 max ⋅ [C ] ⋅ [cAMP]maxKd 3 max ⋅ Kd1 ⋅ ([C ] − Kd 4 ) = [cAMP]max ⋅ ( Kd1 ⋅ Kd 4 − Kd 3 max ⋅ [C ])[cAMP]max =Kd 3 max ⋅ Kd1 ⋅ ([C ] − Kd 4 )Kd1 ⋅ Kd 4 − Kd 3 max ⋅ [C ](Б.28)Если Kd3max = 1,2·10-7М (см.
раздел Б.1.9.1), то [cAMP]max = 2,8·10-6МТаким образом, значение [cAMP]max превышает значение 1,8·10-6М, полученное вэксперименте, а следовательно, принятые нами значения Kd1, Kd4 и [cAMP] согласуются междусобой. Оценим значения остальных констант (см. таблица Б.1):1) Kd3 = 7,8·10-8М.
Такое значение константы связывания меньше, чем для комплекса RAC(1,2·10-7М), но больше чем для комплекса RABC WT (5,6·10-8М, как следует изэкспериментальных данных), что подтверждает корректность произведенной оценки.2) Kd2 = 3,1·10-8М, что более чем на порядок больше значения, полученного эксперимен-тально (см. таблица 1.1). Однако экспериментальное значение представляется далеким отистины, так как маловероятно, чтобы комплексы RABC R333K и RABC R209K имели однои то же значение Kd2, как то получено в эксперименте.Б.1.9.4. Комплекс RABC R209KВ мутантном комплексе RABC R209K цАМФ связывает не А-домен, а B-домен, поэтомуни один из путей, предложенных на рисунке Б.2 не подходит к описанию этой системы.
Тем неменее приведенные выше соотношения между константами остаются справедливыми.Примем,чтонамизэкспериментаизвестнызначенияKd 4 = 4,0 ⋅10 −11 M ,Kd1 = 6,0 ⋅10 −7 M и K акт = 1,7 ⋅10 −6 M .При оценке значений констант будем пользоваться соотношениями (Б.26) и (Б.27):Kd 2 =Kd1 ⋅ ([C ] − Kd 4 )+ [C ][cAMP ]Kd 3 =Kd1 ⋅ Kd 4Kd1 ⋅ Kd 4 ⋅ [cAMP ]=Kd 2Kd1 ⋅ ([C ] − Kd 4 ) + [C ] ⋅ [cAMP](Б.26)(Б.27)В результате получаем (см. таблица Б.1):1) Kd2 = 1,9·10-9М2) Kd3 = 1,3·10-8МОба оцененных значения находятся в хорошем соответствии с экспериментальнымиданными (таблица 1.1)163Таблица Б.1 – Значения констант, характеризующих активацию ПКА Iα с одним доступным длялиганда сайтом связыванияКонстантаЗначение, MИсточник значения константыRAC WT-5Оценена в разделе Б.1.9.1Kd14,0·10Kd26,7·10-8Эксперимент (таблица 1.1, прил.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
