Диссертация (1145986), страница 34

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 34)

// J. Chem. Phys. 2007. V. 126, N 15.155102.94. Fraccalvieri, D. Conformational and functional analysis of molecular dynamics trajectories byself-organising maps / D. Fraccalvieri, A. Pandini, F. Stella et al. // BMC Bioinformatics. 2011. V. 12,N 1. 158.95. Statistica, version 10. Tulsa: StatSoft Inc., 2011.96. Loohach, R. Effect of distance functions on K-means clustering algorithm / R.

Loohach,K. Garg // Int. J. Comput. Appl. 2012. V. 49, N 6. P. 7–9.97. de Groot, B. L. Essential dynamics of reversible peptide folding: Memory-free conformationaldynamics governed by internal hydrogen bonds / B. L. de Groot, X. Daura, A. E. Mark et al. //J. Mol. Biol. 2001. V. 309.

P. 299–313.14098. SPSS for Windows, Rel. 20.0.0. Chicago: SPSS Inc., 2011.99. Wang, Y. Implementation of accelerated molecular dynamics in NAMD / Y. Wang, C. B.Harrison, K. Schulten et al. // Comput. Sci Disc. 2011. V. 4. 015002.100. Hammelberg, D. Accelerated molecular dynamics: a promising end efficient simulationmethodfor biomolecules / D. Hammelberg, J. Mongan, J.

A. McCammon // J. Chem. Phys. 2004.V. 120, N 24. P. 11919–11929.101. Bhandarkar, M. NAMD user’s guide version 2.8b1 / M. Bhandarkar, A. Bhatele, E. Bohm etal. Urbana: University of Illinois, 2011.102. NAMD: mailing list / J. Wereszczynski, 2012.Режим доступа: http://www.ks.uiuc.edu/Research/namd/mailing_list/namd-l.2011-2012/3849.html103. Humphrey, W. VMD – visual molecular dynamics / W. Humphrey, A. Dalke, K. J.

Schulten //J. Mol. Graphics. 1996. V. 14, N 1. P. 33–38.104. Koradi, R. Molmol 2K.1 / R. Koradi. Zurich: ETH, 2003.105. Das, R. A Model for agonism and antagonism in an ancient and ubiquitous cAMP-bindingdomain / R. Das, G. Melacini // J. Biol. Chem. 2007. V. 282, N 1. P. 581–593.106. Wu, J. RIa Subunit of PKA: A cAMP-free structure reveals a hydrophobic capping mechanismfor docking cAMP into site B / J. Wu, S. Brown, N.-H.

Xuong et al. // Structure (Camb). 2004. V. 12,N 6. P. 1057–1065.107. Steinberg, R. A. Mutations that alter the charge of type I regulatory subunit and modifyactivation properties of cyclic AMP-dependent protein kinase from S49 mouse lymphoma cells /R. A. Steinberg, K. B. Gorman, D. Ogreid et al. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266, N 6. P. 3547–3553.108. Baker, N. A. Electrostatics of nanosystems: application to microtubules and to the ribosomes //N. A. Baker, D. Sept, J. S. Holst et al. / P.

Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98, N 18. P. 10037–10041.109. Wu, J. PKA type IIα holoenzyme reveals a combinatorial strategy for isoform diversity /J. Wu, S. H. J. Brown, S. von Daake et al.// Science. 2007. V. 318, N 5848. P. 274–279.110. E, W.

Modeling rare transition events: lecture / W. E, E. Vanden-Eijnden . N.Y.: Courant Inst.of Math. Sci., 2013. Режим доступа: http://www.cims.nyu.edu/~donev/Teaching/CoarseGrainingFall2013/Lectures/TransitionTheory_Review.pdf111. Zhao, R. Maximum flux transition paths of conformational change / R. Zhao, J.

Shen,R. D. Skeel // J. Chem. Theory Comput. 2010. V. 6, N 8. P. 2411–2423.112. Maragliano, L. String method in collective variables: minimum free energy paths andisocommittor surfaces / L. Maragliano, A. Fischer, E. V. Eijnden et al. // J. Chem. Phys. 2006. V. 125.024106.141БЛАГОДАРНОСТИАвтор искренне благодарит своего научного руководителя Василия ЕвгеньевичаСтефанова за предоставленную тему и поддержку на протяжении всех этапов исследования,профессора Елену Владимировну Савватееву-Попову и старшего научного сотрудника БорисаФедоровича Щеголева за интерес и внимание к работе, а также конструктивные замечания приее обсуждении.Автор особенно признателен старшему научному сотруднику Елене АндреевнеВершининой за консультации и помощь в математической обработке результатов, приведенныхв пятой и шестой главах и профессору Олегу Евгеньевичу Квятковскому за помощь впроведении расчетов с использованием программного пакета Gaussian.

Автор благодаренсотруднику ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет» АндреюАлександровичу Мамонову за участие в обсуждении результатов.Автор глубоко признателен своему первому научному руководителю покойному АндреюВладимировичу Попову, под руководством которого были начаты исследования.Искренняя благодарность руководству и всему коллективу лабораторий сравнительнойфизиологии сенсорных систем (ФГБУН «Институт эволюционной физиологии и биохимии им.И. М. Сеченова РАН»), нейрогенетики (ФГБУН «Институт Физиологии им. И.

П. ПавловаРАН»)икафедрыуниверситет»).биохимии(ФГБОУВПО«Санкт-Петербургскийгосударственный142ПРИЛОЖЕНИЕ АДанные, приведенные в работах [65] и [42] являются уникальными и представляющимибольшую ценность, так как только эта группа исследователей предприняла попытку установитьзначения констант диссоциации RAC комплекса в присутствии лигандов. Однако при болееподробном знакомстве с данными возникает вопрос: что на самом деле измеряли авторыработы. И ответ на этот вопрос представляется не менее важным, чем сами данные.В основе эксперимента лежало использование флуоресцентно меченой R-субъединицы иэффект гашения флуоресценции при связывании с С-субъединицей.

Константа диссоциацииопределялась как отношение констант скорости диссоциации и ассоциации субъединиц.Что касается методики измерения константы скорости ассоциации субъединиц, то она небесспорна, однако по факту, видимо, дала правдоподобный результат (1,9·107 М-1c-1).Одновременно смешивались R-субъединицы (100 нМ), С-субъединицы (1-6 µM) и лиганд(10 µM для цАМФ и 100 µM для Rp-цАМФS и Sp-цАМФS).

Снижение флуоресценциинаблюдалось в течение 0,2 с. Очевидно, что в системе одновременно протекают двепараллельные реакции: связывание свободной R-субъединицы с лигандом и связываниесвободной R-субъединицы с С-субъединицей. Исходя из экспериментально измеренныхконстант скоростей этих реакций (2,0·107 М-1c-1 и 1,15·106 М-1c-1 для ассоциации R-субъединицыс С-субъединицей и цАМФ соответственно), скорости обеих реакций примерно равны. Поэтомуна первом этапе наблюдения с С-субъединицей ассоциирует свободная R-субъединица и лишьна втором этапе в процесс образования RC комплекса включается лигандсвязанная Rсубъединица. Однако авторы не наблюдали двухстадийной кинетики связывания, поэтому ихвывод о независимости константы скорости ассоциации от присутствия лиганда звучит вполнеубедительно.

Более того, сложно предположить, что константа ассоциации в присутствиилиганда будет больше, чем в его отсутствие. Поэтому даже если допустить возможность ошибкисо стороны авторов, то ошибка эта может состоять только в завышении константы скоростиассоциации субъединиц в присутствии лиганда, а следовательно, в занижении равновеснойконстанты диссоциации соответствующего RC комплекса.С методикой измерения константы скорости диссоциации R- и С-субъединиц ситуацияобстоит несколько сложнее. С одной стороны, эта методика более прозрачная и понятная, недопускающаяпротеканияпараллельныхреакций.Сдругойстороны,обработкаэкспериментальных результатов представляется нам не совсем корректной.

Вкратце, RCкомплекс (100 нМ) смешивался с избытком немеченой R-субъединицы и лигандами (10 µM дляцАМФ и 100 µM для Rp-цАМФS и Sp-цАМФS). Наблюдался рост флуоресценции, которыйавторы описывают в виде одноэкспоненциальной кинетики. Собственно использование143одноэкспоненциальной кинетики и вызывает вопрос в этой методике. И чтобы оценить границыее применимости, мы решили построить модель, протекающих в системе процессов.Для начала рассмотрим одностадийный процесс диссоциации RC комплекса в отсутствиелигандов:k+[ RC ] ←[ R] + [C ]→k−При этом отметим, что, вследствие избытка немеченых субъединиц, ассоциацию субъединиц мыне наблюдаем, и скоростью этого процесса можно пренебречь.Запишем и решим уравнение скорости диссоциации RC комплекса:d [ RC ]= −k + [ RC ]dtd [ RC ]= − k +dt[ RC ]ln[ RC ] = −k +t + constПусть начальная концентрация RC комплекса равна [RC]0, тогда:[ RC ] = [ RC ]0 e − k + t .По закону сохранения масс выполняется равенство:[ RC ] + [ R ] = [ RC ]0 .Тогда:[ R ] = [ RC ]0 − [ RC ]0 e − k +t(А.1)Именно эта одноэкспоненциальная модель и использовалась авторами работы приопределении константы скорости диссоциации RC комплекса как в отсутствие, так и вприсутствии лигандов.Рассмотримпроцессы,протекающиевприсутствиицАМФ.Многочисленныеэкспериментальные данные [42, 43] показывают, что процесс в этом случае становитсядвухстадийным:k +1k +2[ RC ] + [cAMP ] ←→[ RCcAMP] ←→[ RcAMP ] + [C ] .k −1k− 2Как и в случае диссоциации RC комплекса в отсутствие лигандов ассоциацией R и Ссубъединиц, определяемой константой скорости k-2, можно пренебречь.

Тогда имеем систему изтрех уравнений, описывающую все значимые процессы. d [ RC ] dt = − k +1[ RC ] ⋅ [cAMP] + k −1[ RCcAMP ] d [ RCcAMP ]= k +1[ RC ] ⋅ [cAMP ] − (k −1+ k + 2) ⋅ [ RCcAMP ]dt d [ RcAMP ] =k + 2[ RCcAMP ]dt(А.2)144Концентрация цАМФ, используемая в эксперименте, довольно большая. Поэтому можноее принять за константу и вследствие этого ввести приближение k +′1 = k+1 ⋅ [cAMP] . Тогда система(А.2) преобразуется в систему (А.3). d [ RC ] dt = − k ′+1[ RC ] + k −1[ RCcAMP] d [ RCcAMP]=k ′+1[ RC ] − (k −1+ k +2) ⋅ [ RCcAMP]dt d [ RcAMP] = k +2[ RCcAMP]dt(А.3)Введем обозначения [RC] = x, [RCcAMP] = y, [RcAMP] = z и решим систему уравнений: dx dt = − k ′+1x + k −1y dy = k ′+1x − (k −1+ k +2) ⋅ y dt dz = k +2y dt(А.4)Из второго уравнения системы получим соотношения (А.5) и (А.6): dy−  + k + 2y  = k −1y − k ′+1x dt(А.5)1 dy (k −1+ k + 2)+⋅yk ′+1 dtk ′+1(А.6)x=Продифференцируем выражение (А.6):dx1 d 2 y (k −1+ k + 2) dy=+⋅dt k ′+1 dt 2k ′+1dt(А.7)и подставим выражения (А.5) и (А.7) в первое уравнение системы (А.4):1 d 2 y (k −1+ k +2) dydy+⋅= − − k + 2y2k ′+1 dtk ′+1dtdt(А.8)Упростим уравнение (А.8):1 d 2 y (k −1+ k + 2+ k ′+1) dy+⋅ + k + 2y = 0k ′+1 dt 2k ′+1dtd2ydy+ (k −1+ k + 2+ k ′+1) ⋅ + k ′+1⋅k + 2y = 02dtdtРешим квадратное уравнение (А.9):λ2 + (k −1+ k +2+ k ′+1) ⋅ λ + k ′+1⋅k +2= 0 – характеристическое уравнениеD = b 2 − 4acD = (k −1+ k +2+ k ′+1) 2 − 4 ⋅k ′+1⋅k + 2= (k −1−k +2+ k ′+1) 2 + 4 ⋅k +2⋅k −1Из первого выражения для дискриминанта следует, что(А.9)145D < k −1+ k +2+ k ′+1(А.10)Из второго выражения следует то, что дискриминант всегда положителен, аследовательно, корень из него является вещественным числом.Характеристическое уравнение имеет два корня:λ1, 22− b ± D − (k −1+ k +2+ k ′+1) ± (k −1+ k +2+ k ′+1) − 4 ⋅k ′+1⋅k +2==2a2(А.11),причем, исходя из выражения (А.10) оба корня положительны.В результате решением уравнения (А.9) является функцияy (t ) = C1e λ1t + C2e λ2t(А.12)y = [RCcAMP] .

Поэтому y (0) = [ RCcAMP]0 = 0 , следовательно C1 = −C2 .Таким образом, выражение (А.12) преобразуется в (А.13)y (t ) = C1eλ1t − C1eλ 2 tНайдем(А.13).dy:dtdy= C1λ1eλ1t − C1λ2eλ 2 tdt(А.14)и подставим выражения (А.14) и (А.13) в выражение (А.6):x(t ) =()(1(k + k )C1λ1e λ1t − C1λ2e λ2t + −1 +2 ⋅ C1e λ1t − C1e λ2tk ′+1k ′+1)Определим значение коэффициента С1 на основании того, что x = [RC ] и x(0) = [ RC ]0 .x ( 0) =1(C1λ1 − C1λ2 ) + (k −1+ k +2) ⋅ (C1 − C1 ) = C1 (λ1 − λ2 ) = C1 ⋅ (k −1+ k +2+ k ′+1) 2 − 4 ⋅k ′+1⋅k +2k ′+1k ′+1k ′+1k ′+1[ RC ]0 =C1 =C1⋅ (k −1+ k +2+ k ′+1) 2 − 4 ⋅k ′+1⋅k + 2k ′+1[ RC ]0 ⋅k ′+1(k −1+ k + 2+ k ′+1) 2 − 4 ⋅k ′+1⋅k +2Таким образом, окончательные выражения для y(t) и x(t):y (t ) =x(t ) =[ RC ]0 ⋅k ′+1(k −1+ k + 2+ k ′+1) − 4 ⋅k ′+1⋅k + 22[ RC ]0(k −1+ k + 2+ k ′+1) − 4 ⋅k ′+1⋅k +22(eλ1t − eλ 2 t ){(λ +k1+ k +2) ⋅ e λ1t − (λ2 + k −1+ k + 2) ⋅ e λ2t−1(А.15)}(А.16)По закону сохранения масс для z(t) справедливо выражение:z (t ) = [ RC ]0 − x(t ) − y (t )Подставим в выражение (А.17) выражения (А.15) и (А.16).

Характеристики

Список файлов диссертации