Диссертация (1145986), страница 31
Текст из файла (страница 31)
В ходе исследования мы установили, что за этим фактом стоит рядважных функций, закрепившихся за остатком в 209-ом положении и не связанных с егоучастием в электростатическом «переключателе». К этим функциям относятся: (а) фиксациялиганда в связывающем сайте; (б) поддержание конформации β2β3-петли; (в) созданиестерически благоприятных условий для размещения A202 в положении, характерном для Bконформации, и стабилизация этого положения путем образования взаимодействия междубоковыми цепями A202 и R209. Согласно полученным результатам, аргинин наилучшимобразом совмещает выполнение всех перечисленных функций, что способствует появлениюустойчивого энергетического минимума, соответствующего B-конформации, и, вероятно,уменьшению высоты энергетического барьера перехода в него.
Другие рассмотренные намиостатки оказываются не способными к выполнению той или иной из обозначенных функций,вследствие чего B-конформация становится менее устойчивой. Сила их дестабилизирующеговлияния на B-конформацию в присутствии цАМФ увеличивается в ряду I<K<E(G), а в128отсутствие цАМФ – в ряду I<E<G<K. Сопоставление этих рядов с экспериментальнымиданными по активации ПКА Iα [34] дает основание полагать, что склонность к формированиюB-конформации определяет корректное функционирование, как отдельных цАМФ-связывающихдоменов, так и целого белка.Дополнения к модели гидрофобного «переключателя» L203-Y229, предложеннойХольгером РехманномПроведенные нами исследования подтвердили, что гидрофобный «переключатель»L203–Y229 [30, 33] представляет собой обязательный элемент механизма, лежащего в основеперехода А-домена RIα из H- в В-конформацию.
Согласно модели Рехманна, его переключение,индуцированное цАМФ, сводится к двум последовательным событиям: смещению боковойцепи L203, приводящему к снятию блока L203–Y229 с поворота B/C-спирали, и собственноповороту B/C-спирали. Используя преимущества методов молекулярного моделирования, мывнесли ряд дополнений в эту модель. Во-первых, мы установили, что смещение боковой цепиL203 (ее упаковывание в гидрофобный карман, образованный β2β3-петлей) происходитвследствиепереключения«переключателе»взаимодействийвописанномцАМФ(O6)–A202(N-H)–G199(C=O).намиВо-вторыхмыэлектростатическомопределили,чтодвижущей силой поворота B/C-спирали является на первых этапах сохранение взаимодействиямежду остатками Y229 и L203, а затем повышение энергии взаимодействия остатка Y229 с βсубдоменом в целом.
В-третьих, мы указали на частичное смещение N3A-мотива понаправлению от ФСК как на обязательное условие поворота B/C-спирали, без выполнениякоторого снятие блока с гидрофобного «переключателя» не является полным. Важно отметить,что последнее дополнение справедливо для всех цАМФ-связывающих доменов, кроме доменовбелка EPAC, исследованием которых и занимался Рехманн. У этих доменов N3A-мотив и в H- иВ-конформациях занимает одно и то же положение относительно ФСК и не блокирует поворотB/C-спирали.Механизм перехода А-домена RIαα из H- в В-конформациюОсновываясь на результатах проведенного нами моделирования, мы предложилиследующую схему перехода А-домена RIα из H- в В-конформацию, представляющую собойчастично детерминированную последовательность описанных нами событий: 1) Б, 2) В1, Г1, 3)Д, 4) Г2[В2], Е, 5) И.Событие Б представляет собой переход ФСК из H- в В-конформацию, включаяупаковывание боковой цепи L203 в гидрофобный карман.
В рамках этого события работаетописанный нами электростатический «переключатель» цАМФ(O6)–A202(N-H)–G199(C=O).Событие В заключается в смещении N3A-мотива в сторону от ФСК, событие Г – в повороте129B/C-спирали, а событие Д – в увеличении энергии взаимодействия остатка Y229 с βсубдоменом. События В и Г имеют тенденцию осуществляться в два этапа, для указания накоторые введены метки "1" и "2", причем на втором этапе протекание события Г определяетсясобытием В, что обозначено как Г2[В2]. Совокупность событий Б, В1, Г1 и Д соответствуетдополненной нами модели гидрофобного «переключателя» Рехманна.
Завершающие переходсобытия Е и И специфичны для А-доменов протеинкиназ А и B-доменов белков EPAC. В основесобытия Е лежит переход фрагмента B/С-спирали из α- в π-форму и сопутствующее емуувеличение энергии взаимодействия B/С-спирали с ФСК и N3A-мотивом. Событие Изаключается в образовании излома B/C-спирали на месте фрагмента π-спирали, а также вфиксации этого излома с помощью электростатического взаимодействия R241–E200 и вменьшей степени вандерваальсова взаимодействия L238–I204.Очередностипунктовприведеннойсхемысоответствуетреализацияпроцессаконформационного перехода А-домена во времени. События, указанные в одном пункте, могутнаступать в произвольной последовательности, в том числе одно на фоне другого.
Напротив,для событий, указанных в разных пунктах, действует определенный порядок: каждое изсобытий последующего пункта может наступать одновременно с событиями предыдущегопункта, но не ранее их.Простым описанием установленного механизма перехода А-домена RIα из H- в Вконформацию может служить представление его в виде трех последовательных этапов.
Напервом этапе (пункт 1 вышеуказанной схемы) в ответ на связывание лиганда B-конформациюпринимает ФСК. На втором этапе (пункты 2 – 4), благодаря смещению N3A-мотива иупаковыванию боковой цепи L203 в гидрофобный карман, образованный β2β3-петлей,поворачивается B/C-спираль, а в ее структуре, вследствие стремления остатков L233 и M234 кболее выгодному гидрофобному окружению, формируется виток π-спирали. На третьем этапе(пункт 5) в результате сближения боковых цепей R241 и E200 на месте витка π-спиралиобразуется излом, который разделяет B/C-спираль на отдельные B- и С-спирали.Последовательность событий, положенная нами в основу перехода А-домена RIα из H- вВ-конформацию, является первым приближением к пути минимальной свободной энергии(ПМСЭ) этого перехода.
Ее уточнение и построение профиля свободной энергии вдольуточненного ПМСЭ входит в планы наших дальнейших исследований.130ВЫВОДЫ1) цАМФ запускает переход А-домена регуляторной субъединицы ПКА Iα из H- в Вконформацию посредством электростатического «переключателя» цАМФ(O6)–A202(N-H)–G199(C=O), передающего информацию о связывании цАМФ на гидрофобный «переключатель»L203–Y229.2) Электростатический «переключатель» R209–D170–R226 не задействован в переходеА-домена регуляторной субъединицы ПКА Iα из H- в В-конформацию. Однако аминокислотныйостаток в положении 209 выполняет ряд важных функций, к которым относятся: (а) фиксациялиганда в связывающем сайте; (б) поддержание конформации β2β3-петли; (в) созданиестерически благоприятных условий для размещения A202 в положении, характерном для Bконформации, и стабилизация этого положения путем взаимодействия с боковой цепью A202.Аргинин в положении 209 наилучшим образом совмещает выполнение всех перечисленныхфункций, что является причиной его инвариантности во всех цАМФ-связывающих доменах.3) Гидрофобный «переключатель» L203–Y229 представляет собой обязательный элементмеханизма, лежащего в основе перехода А-домена регуляторной субъединицы ПКА Iα из H- вВ-конформацию.ДвижущейсилойповоротаB/C-спирали,происходящегоприегопереключении, является на первых этапах сохранение взаимодействия между Y229 и L203, азатем повышение энергии взаимодействия Y229 с β-субдоменом в целом.
В А-домене ПКА Iα,какиврядедругихцАМФ-связывающихдоменов,дляпереходагидрофобного«переключателя» в состояние, соответствующее B-конформации, необходимо смещение N3Aмотива от фосфат-связывающей кассеты.4) Переход А-домена регуляторной субъединицы ПКА Iα из H- в В-конформациюпроисходит в три последовательных этапа. На первом этапе в ответ на связывание лиганда Bконформацию принимает фосфат-связывающая кассета. На втором этапе происходит смещениеN3A-мотива, поворот B/C-спирали и формирование в ее структуре витка π-спирали.
На третьемэтапе на месте витка π-спирали образуется излом, который разделяет B/C-спираль на отдельныеB- и С-спирали.131СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ6-AH-цАМФ – циклический N6-(6-аминогексил)аденозин-3`,5`-монофосфат8-AHA-цАМФ – циклический 8-(6-аминогексил)аминоаденозин-3`,5`-монофосфата. о. – аминокислотные остаткиМД – молекулярная динамикаПКА – протеинкиназа АПКА Iα – протеинкиназа А IαПКГ – протеинкиназа ГПКИ – протеинкиназы А ингибиторПМСЭ – путь минимальной свободной энергииПМЭ – путь минимальной энергииуМД – ускоренная молекулярная динамикаФСК – фосфат-связывающая кассетацАМФ – циклический аденозин-3`,5`-монофосфатЯМР – ядерно-магнитный резонансC-субъединица – каталитическая субъединицаcAMP – обозначение цАМФ, используемое в двух случаях: 1) для обозначения концентрациицАМФ – [cAMP], 2) для обозначения лиганд-белковых комплексов (например, RcAMP – Rсубъединица, в одном из цАМФ-связывающих сайтов которой находится цАМФ)CAP – catabolite activator protein (белок-активатор катаболитных оперонов)CNG – cyclic nucleotide-gated ion channels (каналы, активируемые циклическими нуклеотидами)EPAC – exchange protein directly activated by cAMP (ГДФ/ГТФ обменный белок, напрямуюактивируемый цАМФ)HCN – hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-modulated channels (гиперполяризационноактивируемые каналы, управляемые циклическими нуклеотидами)PC – главная компонента (principle component) в факторном анализеR-субъединица – регуляторная субъединицаRIα – регуляторная субъединица IαRA – R-субъединица, содержащая только А-доменRAB – R-субъединица, содержащая оба цАМФ-связывающих доменаRC комплекс – неактивный комплекс R- и C-субъединицRAC комплекс – RC комплекс, R-субъединица которого содержит только А-доменRABC комплекс – RC комплекс, R-субъединица которого содержит оба цАМФ-связывающихдомена132RCcAMP – «тройной комплекс» - комплекс R- и С-субъединиц в цАМФ-связанной формеRMSD – root mean square deviation/distance (среднеквадратичное отклонение/расстояние)Rp-цАМФS – циклический аденозин-3`,5`-монофосфотиоат, Rp-изомерSp-цАМФS – циклический аденозин-3`,5`-монофосфотиоат, Sp-изомер133СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1.
Skalhegg, B. S. Specificity in the cAMP/PKA signaling pathway. Differential expression,regulation, and subcellular localization of subunits of PKA / B. S. Skalhegg, K. Tasken // Front. Biosci.1997. V. 2. P. 331–342.2. Fimia, G. M. Cyclic AMP signaling / G. M Fimia, P. Sassone-Corsi // J. Cell Sci. 2001. V. 114.P. 1971–1972.3. Johnson, D. A. Dynamics of cAMP-dependent protein kinase / D.
A. Johnson, P. Akamine,E. Radzio-Andzelm et al. // Chem. Rev. 2001. V. 101. P. 2243–2270.4. Kim, C. W. PKA-I holoenzyme structure reveals a mechanism for cAMP-dependent activation /C. Kim, C. Y. Cheng, A. S. Saldanha et al. // Cell. 2007. V. 130. P. 1032–1043.5. Badireddy, S. Cyclic AMP analog blocks kinase activation by stabilizing inactive conformation:Conformational selection highlights a new concept in allosteric inhibitor design / S. Badireddy,G.
Yunfeng, M. Ritchie et al. // Mol. Cell. Proteomics. 2011. V. 10. M110.004390.6. Su, Y. Regulatory subunit of protein kinase A: structure of deletion mutant with cAMP bindingdomains / Y. Su, W. R. Dostmann, F. W. Herberg et al. // Science. 1995. V. 269, N 5225. P. 807–813.7. Dostmann, W. R. G. (Rp)-cAMPS inhibits the cAMP-dependent protein kinase by blocking thecAMP-induced conformational transition / W.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
