Диссертация (1145986), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Вопрос о том, почему вэкспериментах Рехманна не наблюдалось блокирование гидрофобного «переключателя» N3Aмотивом, снимается сравнением моделей исследования. Рехманн работал на белках EPAC, укоторых N3A-мотив и в H- и В-конформации занимает одно и то же положение в удалении отФСК (подробнее раздел 6.4.2).Событие Е, показанное на схеме 6.1 зеленым цветом, может произойти сразу за событиемБ, но с гораздо большей вероятностью следует за событием Д. Заключается оно в переходефрагмента B/C-спирали (Y229 – G235) в π-форму, сопровождаемом поворотом боковой цепиL233 к гидрофобным остаткам N3A-мотива и β-субдомена (L135, F136, L139, F172), а боковойцепи M234 к остатку ФСК I204 (рисунок 6.6). Можно предположить, что причиной события Еявляется стремление L233 и M234 к созданию выгодного гидрофобного окружения иувеличению таким образом энергии своего взаимодействия с близлежащими остатками. В такомслучае образование фрагмента π-спирали является вынужденной мерой, призванной за счетуменьшения кривизны витка спирали обеспечить правильное положение боковых цепей L233 иM234.Реализацию события Е мы наблюдали по коррелированному изменению значений шестипараметров: два из них – энергии взаимодействия остатков L233 и M234 с образующимсягидрофобным окружением (L233 с L135, F136, L139 и F172, а M234 с I204), два других –водородные связи, характерных для α-спирали R230(C=O)–M234(N-H), R231(C=O)–G235(N-H)и два оставшихся – водородные связи, характерные для π-спирали Y229(C=O)–M234(N-H),R230(C=O)–G235(N-H).
В ходе реализации события Е названные энергии увеличивались,водородные связи, свойственные α-спирали разрывались, а свойственные π-спирали –образовывались.110А.Б.А – Фрагмент А-домена перед совершением события Е; Б – Фрагмент А-домена после совершения события Е.Лентами разных цветов показаны надвторичные структуры А-домена: желтой – ФСК, розовой – N3A-мотив,пурпурной –B/C-спираль, фиолетовой – β2β3-петля.
Серым цветом обозначен виток B/C-спирали, претерпевающийпереход в π-форму. Отмечены остатки I204, L135, F136, L139, L233 и M234, обсуждаемые в текстеРисунок 6.6 – Событие Е: переход фрагмента B/C-спирали (Y229 – G235) в π-форму,сопровождаемый поворотом боковой цепи L233 к N3A-мотиву, а боковой цепи M234 к ФСКВажным последствием события Е является не только стабилизация положения N3Aмотива и B/C-спирали относительно друг друга и ФСК за счет возникших гидрофобныхвзаимодействий, но и предуготовление B/C-спирали к формированию излома.Событие И – последнее в череде событий, определяющих конформационный переход Адомена.
На схеме 6.1 оно выделено бирюзовым цветом. Состоит событие И (рисунок 6.7) вформировании излома B/C-спирали и в образовании двух взаимодействий между получившейсяС-спиралью и ФСК: сильного электростатического, между боковыми цепями R241 и E200, ислабого гидрофобного, между боковыми цепями L238 и I204 (последнее в наших расчетахреализовывалосьневсегда).Обавзаимодействия,ноглавнымобразом,конечно,электростатическое, поддерживают достигнутый угол между B- и С-спиралями, о чем говоритвосстановление единой B/C-спирали после разрушения связи R241–E200, показанное в сериикомпьютерных расчетов [36]. По результатам этих расчетов можно сделать вывод, что причинойформирования излома B/C-спирали является сближение боковых цепей R241 и E200 приобразовании взаимодействия между ними.
Подтверждает этот вывод структура, приведенная нарисунке 6.7 А. Она иллюстрирует тот факт, что хотя оба остатка находятся в вытянутойконформации, в отсутствие излома или изгиба спирали расстояние между ними остаетсядостаточно большим.Особый интерес представляет собой участок B/C-спирали, на месте которогоформируется излом. Дело в том, что α-спираль – достаточно стабильная структура, и сломать еесложно даже при помощи электростатического взаимодействия.
Но фрагмент π-спирали гораздоменее устойчив, поэтому излом появляется на месте витка π-спирали, а первым остатком Сспирали оказывается G235. В таком случае образно можно сказать, что сближение боковых111цепей R241 и E200 ломает стержень B/C-спирали в том месте, где он уже был надломлен.О протекании события И свидетельствует коррелированное изменение значений семипараметров. Во-первых, возрастают энергии взаимодействия боковых цепей R241 и E200, атакже L238 и I204. Во-вторых, увеличиваются расстояния между атомами R231(C=O) и G235(NH), R230(C=O) и G235(N-H), R231(C=O) и S236(N-H), I232(C=O) и S236(N-H), маркируя собойместо излома.
И наконец в-третьих, последний раз за переход уменьшается RMSDB(B/C-h). Вцелой R-субъединице, помимо перечисленных изменений, событие И должно включать в себятакже образование стэкинг-взаимодействия между ароматическим кольцом лиганда и остаткомN3A-мотива B-домена W260 (кэпом) [54]. Но так как мы рассматриваем отдельный А-домен,кэпирования аденина в наших моделированиях не происходит.А.Б.А – А-домен перед совершением события И; Б – А-домен после совершения события И (B-конформация).
Лентамиразных цветов показаны надвторичные структуры А-домена: бирюзовой – β-субдомен, кроме ФСК и β2β3-петли,желтой – ФСК, розовой – N3A-мотив, пурпурной –B/C-спираль, фиолетовой – β2β3-петля. Отмечены остатки R241и E200, обсуждаемые в текстеРисунок 6.7 – Событие И: формирование излома B/C-спирали на месте фрагмента π-спирали,сопровождаемое образованием взаимодействия между боковыми цепями R241 и E200Конформация А-домена, образовавшаяся после завершения события И, по совокупностивсех признаков является В-конформацией. Более подробно вопрос сопоставимости полученныхнами данных с данными рентгеноструктурного анализа освещен в разделе 6.1.6.4.
Описание первого приближения к пути минимальной свободной энергии(ПМСЭ) перехода А-домена из H- в B-конформациюНа основании данных, приведенных на рисунке 6.1, а также учитывая все изложенные вразделе 6.3 закономерности в наступлении событий, можно предложить следующуюобобщенную схему перехода А-домена из H- в В-конформацию: 1) Б, 2) В1+(B2), Г1, (Е), 3) Д,4) Г2[(В2)], (Е), 5) И. В этой схеме переход к каждому последующему пункту соответствует112развитию процесса во времени.
События, указанные в одном пункте, могут наступать впроизвольной последовательности, в том числе одно на фоне другого. Напротив, для событий,указанных в разных пунктах, действует определенный порядок: каждое из событийпоследующего пункта может наступать одновременно с событиями предыдущего пункта, но неранее их. Метками "1" и "2" обозначены два этапа в реализации событий В и Г, о которыхговорилось в разделе 6.3.3. В скобки взяты события, совершение которых в рамках данногопункта необязательно. Наиболее вероятное положение события Е в череде других событийвыделено жирным шрифтом. Запись Г2[(В2)] сделана в соответствии с данными, изложеннымив предыдущем разделе, и означает, что на этом этапе протекание события Г зависит отпротеканиясобытияВ,еслипоследнеенезавершилосьнапредыдущихэтапахконформационного перехода.Простым описанием к приведенной схеме может служить представление перехода Адомена из H- в В-конформацию в виде трех последовательных этапов.
На первом этапе (пункт 1вышеуказанной) в ответ на связывание лиганда B-конформацию принимает ФСК. На второмэтапе (пункты 2-4), благодаря смещению N3A-мотива и упаковыванию боковой цепи L203 вгидрофобный карман, образованный β2β3-петлей, поворачивается B/C-спираль, а в ееструктуре, вследствие стремления остатков L233 и M234 к более выгодному гидрофобномуокружению, формируется виток π-спирали. На третьем заключительном этапе (пункт 5) врезультате сближения боковых цепей R241 и E200 на месте витка π-спирали образуется излом,который разделяет B/C-спираль на отдельные B- и С-спирали.Учтя наблюдаемые нами (рисунок 6.1) тенденции ряда событий происходить на болеекоротком отрезке пути, чем они могли бы произойти, от обобщенной схемы перехода А-доменав В-конформацию можно перейти к более простой: 1) Б, 2) В1, Г1, 3) Д, 4) Г2[В2], Е, 5) И.
Этапоследовательность является первым приближением к пути минимальной свободной энергии(ПМСЭ). Ее уточнение и построение профиля свободной энергии вдоль уточненного ПМСЭвходит в планы наших дальнейших исследований конформационных переходов цАМФсвязывающих доменов.В заключение этого раздела следует отметить, что единственный промоделированныйнами путь перехода в В-конформацию А-домена с мутационной заменой R209K отличается отпутей перехода доменов дикого типа не более, чем последние различаются между собой.
Такиерезультаты полностью исключают участие электростатического «переключателя» R209–D170–R226 в конформационном переходе А-домена и подтверждают наши выводы, приведенные вглаве 5, о причинах нарушения функционирования ПКА Iα при замене аргинина в 209-омположении на другие аминокислотные остатки.1136.5. Обсуждение результатов6.5.1 Связь изложенных результатов с существующими экспериментальными ирасчетными даннымиИсследование конформационных переходов белков является нестандартной задачей дляприменения экспериментальных методик.
Расчетные методы более перспективны в ее решении,но и их использование сопряжено с рядом трудностей. Дело в том, что конформационныепереходы относятся к классу редких событий в жизни каждого белка, протекание которыхвсегда сопровождается преодолением энтальпийных или энтропийных барьеров [110]. Аследовательно, и расчетные методы, направленные на изучение конформационных переходов,должны представлять собой не способ моделирования естественного поведения системы вовремени, а прием, позволяющий исследовать труднодоступные области энергетическоголандшафта в приемлемые для исследователя сроки. Применять такие методы к большимнесимметричным системам, каковыми являются белки, стали только в последние годы.
Поэтомуне удивительно, что конформационные переходы множества белков, в том числе и цАМФсвязывающих доменов, остались до сих пор практически не изученными.Суммируя все имеющиеся в литературе данные, можно представить следующую картину,отражающую современное представление о конформационных переходах цАМФ-связывающихдоменов. В первичных последовательностях этих доменов в соответствии с исследованиями,проведенными в лаборатории Сьюзен Тэйлор, присутствует четыре консервативных участка,отвечающих четырем надвторичным структурам: ФСК, β2β3-петле, N3A-мотиву и B-спирали[45]. Их консервативность предположительно говорит об их значимости для конформационногоперехода, однако, в чем заключается роль каждой из структур, кроме ФСК, пока до конца неизвестно.
ФСК, как следует из ее названия, связывает лиганд, причем основное участие в этомпринимают пять ее аминокислотных остатков (в А-домене ПКА Iα – G199, E200, A202, R209 иA210) [6]. Эта функция ФСК была определена еще в 80-ых годах прошлого века, а основнойвопрос, стоящий перед исследователями сейчас, заключается в определении одного (илинескольких) из этих остатков, посредством которых лиганд передает информацию о своемприсутствии в связывающем сайте на отдаленные участки домена, то есть посредством которыхзапускается конформационный переход. В лаборатории Сьюзен Тэйлор было предположено, чтоэтим остатком является R209 [5, 32, 65]. Действительно, R209 несет положительный заряд и,следовательно, участвует в сильном электростатическом взаимодействии с отрицательнозаряженной фосфатной группой лиганда. Кроме того, от R209 берет начало цепочкааминокислотных остатков D170–R226, в которой боковая цепь D170 связана либо с R226 (в Hконформации), либо с R209 (в В-конформации). Так возникла модель электростатического114«переключателя» R209–D170–R226, полагающая начало конформационному переходу домена визменении свойств R209 при связывании лиганда и следующем из этого переключении на R209боковой цепи D17027 [5, 32, 65, 105].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
