Диссертация (1145986), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Другие исследуемыенамиостаткилишеныπ-электроннойплотностиинемогутобразовыватьтакоговзаимодействия. Однако изолейцин и глутаминовая кислота частично компенсируют егоотсутствие слабыми электростатическими и вандерваальсовыми взаимодействиями междусвоими боковыми цепями и G169. Таким образом, только эти две системы из всехрассматриваемых могут в некоторой степени поддерживать нужную конформацию β2β3-петли92и моделироваться без ее дополнительной фиксации. Лизин и, очевидно, глицин в 209-омположении не способны стабилизировать необходимый изгиб β2β3-петли и способствуютпроявлению ее естественной конформационной подвижности. В результате возрастает барьермежду Н- и B-конформациями и уменьшается энергия последней.
Как и следует ожидать, Bконформация в этих случаях реализуется достаточно редко и быстро разрушается.Неожиданным для нас стало то, что остаток в 209-ом положении не толькоопосредованно через другие структуры, но и напрямую может влиять на предпочтение домена кB-конформации и скорость перехода в нее.
Как и β2β3-петля, он создает благоприятные илинеблагоприятные (если речь идет о мутационных заменах R209, нарушающих активацию ПКАIα) условия для того, чтобы A202 мог преодолеть энергетический барьер и занять положение,свойственноеB-конформации.Стабилизацияэтогоположенияпутемформированиявзаимодействия между боковыми цепями 202-ого и 209-ого остатков также входит в функциипоследнего. Среди всех исследованных нами аминокислотных остатков только аргинин иизолейцин способствуют таким образом явному преобладанию B-конформации, причемизолейцин, по всей видимости, стабилизирует ее даже лучше, чем аргинин.
цАМФсвязывающие домены с глицином, глутаминовой кислотой или лизином в 209-ом положении,напротив, не характеризуются большой долей B-конформации. У мутантов R209G и R209Eбоковые цепи 202-ого и 209-ого остатков не образуют взаимодействия, стабилизирующего Bконформацию, из-за малого размера глицина (R209G) или удаленности глутаминовой кислотыот положения, занимаемого в норме аргинином (R209E). В случае мутанта K209R ситуацияобратная: боковая цепь лизина (в присутствии цАМФ) или CH2-группа в ее β-положении (вотсутствии цАМФ) стерически препятствуют свойственному B-конформации размещениюбоковой цепи A202.
Также, в присутствии цАМФ, боковая цепь лизина вследствие своейбольшой подвижности стерически дестабилизирует переходное состояние между H- и Bконформациями, что приводит к уменьшению частоты конформационного (H → B) перехода.Таким образом, по крайней мере ряд важных функций остатка в 209-ом положении нереализуются посредством электростатического «переключателя», и некоторые аминокислотныеостатки, не способные к формированию электростатических взаимодействий с D170 и R226,могут без существенных изменений в конформационной динамике А-домена ПКА Iα замещатьсобой остаток аргинина. Тем не менее в большей или меньшей степени, но все рассмотренныенами мутационные замены R209 уменьшают устойчивость B-конформации и предположительноповышают энергетический барьер перехода в нее. Сила их дестабилизирующего влияния на Bконформацию и конформационный переход в присутствии цАМФ увеличивается в рядуI<K<E(G), а в отсутствие цАМФ – в ряду I<E<G<K.
Совпадение установленных нами рядов срядами, полученными экспериментально и характеризующими меру влияния мутаций на93активацию ПКА Iα [34], позволяет утверждать, что чем больше в присутствии мутации заселенаB-конформация, тем меньшее влияние оказывает эта мутация на активацию ПКА.
Видимо,склонность к формированию B-конформации, является определяющей чертой для корректногофункционирования цАМФ-связывающих доменов. И остаток в 209-ом положении играет непоследнюю роль в повышении ее устойчивости и скорости образования. В этой связистабильность в эволюции искомого аргинина определяется его способностью наилучшимобразом совмещать все названные составляющие стабилизации B-конформациии и уменьшениябарьера конформационного перехода в нее.
Другие аминокислотные остатки могут замещатьаргинин, но при этом будут наблюдаться нарушения активации ПКА, от еле заметных (в случаеизолейцина), до существенных (в случае лизина, глицина или глутаминовой кислоты).5.3.3. Электростатический «переключатель» R209–D170–R226 как механизм стабилизацииконечных конформаций А-домена ПКА Iα, а не реализации конформационного переходамежду нимиТот факт, что аргинин в 209-ом положении важен, но не обязателен дляконформационного перехода А-домена ПКА Iα и стабилизации B-конформации, заставляет наспереосмыслить роль, отведенную в литературе электростатическому «переключателю» R209–D170–R226. В соответствии с нашими наблюдениями электростатический «переключатель» неучаствует непосредственно в конформационном переходе домена (в отличие от гидрофобного«переключателя»), а выполняет функцию дополнительной стабилизации B-конформации спомощью водородной связи R209–D170 (рисунок 5.1 А, Г) и Н-конформации с помощьюаналогичной связи R226–D170.
Принимая эту гипотезу, можно объяснить все имеющиесяэкспериментальные данные по функционированию доменов с мутационными заменамиостатков D170, R209 и R226.Мутационные замены R209 рассмотрены нами в предыдущем разделе главы 5. Мы небудем их касаться в этом разделе, а остановимся только на мутационных заменах остатков D170и R226.Центральным звеном электростатического «переключателя» является, несомненно,D170. Мутанты D170A связывают цАМФ почти с той же аффинностью, что и домены белкадикого типа, и не имеют нарушений конформационного перехода [32, 35 ,58]. Однаковнедрение этой мутации приводит к повышению аффинности комплекса регуляторнойсубъединицы и цАМФ (RcAMP) к каталитической субъединице более чем в 10 раз [35].Другими словами, мутантный комплекс регуляторной субъединицы и цАМФ ведет себя так, какесли бы цАМФ был удален денатурацией («лишенный цАМФ» фенотип).
Единственноеобъяснение этой совокупности фактов состоит в том, что замена глутаминовой кислоты на94аланин в положении 170 приводит к уменьшению энергетического барьера для B→H (авероятно и H→B) перехода. В данном случае уменьшение энергетического барьера вряд лисвязано с повышением устойчивости переходного состояния, иначе из всех приведенныхэкспериментальных данных должен следовать вывод, что электростатический «переключатель»усложняет активацию ПКА Iα.
Скорее причина заложена в дестабилизации B-конформации приразобщении связи R209–D170, а энергия переходного состояния остается неизменной. В пользутакого объяснения говорят и данные ЯМР анализа, согласно которым равновесие у D170Aмутантов в отсутствие лиганда по сравнению с белками дикого типа сдвинуто в сторону Нконформации [58]. Тем не менее заселенность B-конформации сохраняется у таких доменовдостаточновысокой,ЭкспериментальноеимутацияподтверждениеD170Aэтомунеделаетполученосееполностьюпомощьюнедостижимой.измерениягашенияфлуоресценции W260 в ответ на связывание цАМФ с сайтом А-домена [35].Остаток R226 расположен на N-конце B/C-спирали, и его боковая цепь в H-конформацииобразует электростатическое взаимодействие с боковой цепью D170.
Мутации R226,разобщающие это взаимодействие, фенотипически проявляются в том, что облегчаютактивацию ПКА Iα (константа активации уменьшается в 20 раз) [32]. Как и в случае мутацийD170, этот факт можно исчерпывающе объяснить уменьшением устойчивости одной изконформаций А-домена при разобщении связи R226–D170. Только в этот раз речь идет,очевидно, об H-конформации. Иными словами, высота энергетического барьера H→Bконформационного перехода у R226A мутанта уменьшается, а энергия переходного состоянияостается неизменной.Интересно, что остаток K242, видимо, играет ту же роль, что и D170, стабилизируя Bконформацию и увеличивая таким образом высоту энергетического барьера между B- и Hконформациями.
Фенотип мутанта K242A такой же, как и у мутанта D170A [35], и, исходя изструктуры белка, маловероятно, что K242 участвует в конформационном переходе А-домена.Мы обратили внимание, что боковая цепь K242 в В-конформации может формироватьводородную связь с ОН-группой боковой цепи Y205. Очевидно, что эта водородная связь, еслисуществует, то выполняет ту же функцию, что и связь R209–D170, то есть повышаетустойчивость B-конформации. Это приводит к двум последствиям: увеличивается доля Вконформации и константа скорости конформационного перехода из B- в H-конформациюуменьшается.
В результате, не воздействуя на механизм конформационного перехода, обаостатка D170 и K242 делают B-конформацию более стабильной и предотвращают реализацию«лишенногоцАМФ»фенотипа.Последнийфактфункционирования ПКА в физиологических условиях.оченьважендляправильного95Таким образом, анализ имеющихся экспериментальных данных в совокупности снашими результатами, изложенными в разделе 5.3.2, позволяет говорить о том, чтоэлектростатический «переключатель» R209–D170–R226, важен для стабилизации H- и Bконформаций, но не играет роли в процессе конформационного перехода А-домена, хотянепосредственно остаток R209 участвует в обоих процессах.
Исследование стабилизации Bконформации с помощью R209–D170 и K242–Y205 связей и H-конформации с помощью R226–D170 связи было за пределами нашего исследования. Однако мы надеемся, что соответствиенашей гипотезы широкому спектру экспериментальных фактов станет основанием дляпереосмысления и дальнейшего исследования роли электростатического «переключателя»R209–D170–R226.В заключение этой главы следует вернуться к обсуждению, начатому в разделе 4.3.2. Внем упоминается, что многие исследователи видят причину обратного агонизма Rp-цАМФS вблокированииконформационногопереходапутемразобщенияэлектростатического«переключателя» R209–D170–R226 [58, 65]. В данном разделе мы попытались показать, чтоэлектростатический «переключатель» важен для стабилизации конечных конформаций домена,однако не играет роли в конформационном переходе.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
