Диссертация (1145986), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Согласно этой моделиRp-цАМФS препятствует смещению амидной группы A326 (A202), наблюдаемому при переходецАМФ-связывающих доменов из H- в B-конформацию, и блокирует таким образом начальныеэтапы работы гидрофобного «переключателя».
В соответствии с предложенной гипотезойсвязывание Rp-цАМФS, как и цАМФ, сопровождается образованием водородной связи междуэкзоциклическим экваториальным атомом серы Rp-цАМФS и амидной группой A326 (A202),однако параметры этой связи в совокупности с положением атома серы делают движение A326(A202) невозможным. В результате Rp-цАМФS-связанный домен оказывается «запертым» в Hконформации.Изложенные в этой главе результаты подтверждаются данными, полученными методомрентгеноструктурного анализа [5] и представляющими собой исследование Rp-цАМФSсвязанного RC комплекса.
В построенной на основе этих данных трехмерной модели (PDB ID3PLQ) между амидной группой A202 и экзоциклическим экваториальным атомом серы S1 RpцАМФS реализована водородная связь длиной 3,4 Ǻ, но при этом А-домен находится в Hконформации. Этот факт полностью согласуется с нашими результатами, однако именно он, нанаш взгляд, не дал исследователям понять ключевую роль смещения остатков A202 (A326) впереходе цАМФ-связывающих доменов из Н- в В-конформацию. Действительно, пока неудалось экспериментальными методами получить комплекс, представляющий собой цАМФсвязывающий домен в H-конформации и при этом содержащий агонист (например, цАМФ) всвязывающем сайте. А, исходя из наших данных, только такие комплексы характеризуютсяотсутствием водородной связи между амидной группой A202 (A326) и лигандом19. В то жевремя те лигандсвязанные комплексы, которые успешно кристаллизуются, либо представляютсобой домен в B-конформации, либо, как упомянуто выше, с доменом в H-конформации связанRp-цАМФS.
И в том и в другом случае на момент экспериментальных наблюдений образованиеводородной связи между экзоциклическим экваториальным атомом кислорода или серы лигандаи амидной группой A202 (A326) в этих комплексах уже завершилось. Таким образом, донастоящего времени негласно полагалось, что искомая связь формируется сразу при связывании19На самом деле, как следует из наших данных, Rp-цАМФS, образуя комплекс с цАМФ-связывающим доменом вН-конформации, так же, как агонисты, не формирует водородной связи с амидной группой A202 (A326). Однакодля того чтобы эта связь реализовалась, необходимы незначительные изменения конформации белка. Совершивэти изменения, домен не выходит из ансамбля H-конформаций. Поэтому формулировка о реализации искомойводородной связи между Rp-цАМФS и доменом, находящимся в H-конформации, является корректной.70цАМФ, как и другие взаимодействия, удерживающие лиганд в сайте (см.
раздел 1.3.1 или 3.1.1).Внести ясность в понимание этого процесса нам удалось благодаря использованию методовмолекулярного моделирования.4.3.2. Экспериментальные подтверждения предложенноймодели обратного агонизма Rp-цАМФSПредложенная нами модель, объясняющая обратный агонизм Rp-цАМФS, существенноотличается от всех предложенных ранее моделей. Во-первых, в литературе предполагается, чтоRp-цАМФS среди всех конформаций цАМФ-связывающего домена отбирает H-конформацию[5].
Мы же считаем, что Rp-цАМФS обладает достаточным сродством к B-конформации, чтобыпереход в нее характеризовался отличной от нуля вероятностью. Во-вторых, многиеисследователивидятпричинуобратногоагонизмаRp-цАМФSвблокированииконформационного перехода путем разобщения электростатического «переключателя» R209–D170–R226 [58, 65]. Напротив, в соответствии с нашей моделью Rp-цАМФS препятствуетработе не электростатического, а гидрофобного «переключателя». В связи с приведеннымирасхождениями вопрос экспериментальных фактов, обосновывающих предложенную намимодель, стоит особо остро.
В данном разделе диссертации мы рассмотрим факты,свидетельствующие в пользу формирования Rp-цАМФS стабильных комплексов, как с H-, так исB-конформациейцАМФ-связывающегодомена.Факты,доказывающие,чтоэлектростатический «переключатель» не играет ключевой роли в конформационном переходецАМФ-связывающих доменов, будут рассмотрены в главе 5.В 2004 году были впервые получены и расшифрованы кристаллические структурыкомплексов ∆(1–91) R-субъединиц ПКА Iα с Rp-цАМФS и Sp-цАМФS [27]. Оказалось, что этикомплексы мало отличаются друг от друга и от аналогичного комплекса с цАМФ.
Во всех трехслучаях оба цАМФ-связывающих домена R-субъединицы находились в В-конформации.Позднее, в 2011 году, удалось получить комплекс ∆(1–90)∆(245–379) R-субъединицы ПКА Iα (Адомен) с Rp-цАМФS, находящийся в Н-конформации [5]. Сравнение методик двух названныхэкспериментов позволяет сделать следующее наблюдение. В эксперименте 2004 года комплексыR-субъединиц с цАМФ не подвергали денатурации для удаления присутствующих всвязывающих сайтах лигандов, а просто использовали вместо цАМФ цГМФ, который, в отличиеот цАМФ, как считалось ранее, можно легко удалить диализом. Однако впоследствии былопоказано, что после диализа А-домен R-субъединицы остается занятым лигандом и оба цАМФсвязывающих домена находятся в В-конформации, причем В-конформация В-домена, вероятно,стабилизируется лигандом в А-сайте [106]. В эксперименте 2011 года Rp-цАМФS добавляли нек свободной RA субъединице, а к RAC комплексу, в котором, как известно, А-домен R-71субъединицы находится в H-конформации.
Иными словами в первом эксперименте Rp-цАМФSсвязывался с белком, который уже был в В-конформации, и получившийся комплекспредставлял собой B-конформацию. Во втором эксперименте белок существовал в Hконформации, и добавление Rp-цАМФS также не изменяло это состояние.Важнаягруппарезультатов,характеризующаястроениеRp-цАМФS-связанныхкомплексов R-субъединиц, была получена методами ЯМР [105, 31], спектрометрии ионнойподвижности / масс спектрометрии [5] и исследования изменения свободной энергии прииндуцированном мочевиной анфолдинге [7].
С использованием этих методик было выявлено,что Rp-цАМФS-связанные комплексы как ∆(1–91), так и ∆(1–90)∆(245–379) R-субъединиц болеевсего по своим характеристикам похожи на соответствующие свободные R-субъединицы. А,исходя из экспериментальных данных, H- и В-конформации А-домена у названных свободныхR-субъединиц заселены примерно в равной мере [31]. Только в одной работе методамианфолдинга и ЯМР было продемонстрировано, что процент H-конформаций у Rp-цАМФSсвязанной RIα(91-244) субъединицы выше, чем у свободной RIα(91–244) субъединицы, но ниже,чем в RAC комплексе [31]. На возможном объяснении полученных в данной работе результатовмы остановимся далее, однако и эти результаты не мешают сделать вывод о возможностисвязывания Rp-цАМФS как с H-, так и с В-конформациями цАМФ-связывающих доменов.Наконец, последняя группа результатов, на которую мы опираемся в своихрассуждениях, – экспериментально показанная активация ПКА Iα с помощью Rp-цАМФS.Очевидно, что Rp-цАМФS ведет себя как агонист ПКА Iα далеко не при всех условиях.
ЧтобыRp-цАМФS мог хотя бы частично активировать ПКА Iα необходимы либо избыток субстрата[34], либо присутствие в цАМФ-связывающем сайте А-домена мутаций, препятствующихсвязыванию лигандов [34, 64]. Как уже обсуждалось в разделе 3.5.4, в обоих названных случаяхRp-цАМФS предположительно фиксирует предсуществующую B-конформацию B-домена, апоследующая диссоциация R- и С-субъединиц происходит спонтанно. В этой связи стоитотметить, что Rp-цАМФS при тех же условиях не является агонистом ПКА IIβ, возможно,именно потому, что B-домен ПКА IIβ, в отличие от ПКА Iα, находится преимущественно в Hконформации [71].Таким образом, многочисленные данные свидетельствуют в пользу того, что Rp-цАМФSобладает сродством как к H- так и к B-конформациям цАМФ-связывающих доменов, причемсродство к B-конформации, вероятно, выше, чем к H.
Это предположение находитподтверждение не только в наших результатах, полученных методом докинга (раздел 3.1.3), но ив простом рассуждении. Действительно, какой бы механизм ни лежал в основе антагонизма RpцАМФS, он не распространяется на переход домена из B- в H-конформацию, так как этотпереход не зависит от лигандов. Тогда, если предположить, что комплекс цАМФ-связывающего72домена с Rp-цАМФS в H-конформации более выгоден по энергии, чем соответствующийкомплекс в В-конформации, последний комплекс должен переходить в первый.
Однако это непроисходит, о чем свидетельствуют и данные рентгеноструктурного анализа [27], иисследования агонизма Rp-цАМФS [34, 64]. Иными словами цАМФ-связывающий домен вкомплексе с Rp-цАМФS, находясь в В-конформации, представляет собой термодинамическивыгодную стабильную структуру.В то же время нельзя оставить без внимания тот факт, что при равных частотах H- и Bконформаций Rp-цАМФS либо взаимодействует с обеими с равной вероятностью, либо отдаетпредпочтение Н-конформации.
Мы полагаем, что это связано с кинетическими факторами, тоесть предположительно с большей константой скорости связывания Rp-цАМФS с Hконформацией. Вероятно, другие лиганды, в том числе и цАМФ, также оказывают кинетическоепредпочтение H-конформации. Однако агонисты тут же вызывают переход домена в Вконформацию,аRp-цАМФSпрепятствуетему.Такимобразом,равновесиемеждуконформациям смещается в первом случае в сторону B-конформации, а во втором случае всторону H.4.4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
