Диссертация (1145986), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Суммируя приведенныеданные, можно сказать, что Rp-цАМФS-связанный B-домен в В-конформации хоть ипредставлялся несколько деформированным в сравнении с цАМФ-связанным B-доменом,однако существенно от него не отличался, что полностью подтверждается даннымирентгеноструктурного анализа [27].Выявленные особенности взаимодействия Rp-цАМФS со связывающими сайтами немогли не сказаться на термодинамических оценках. Оба комплекса Rp-цАМФS с B-доменомоказались слабее, чем аналогичные комплексы, образованные при участии цАМФ.Стандартное изменение свободной энергии связывания Rp-цАМФS с B-доменом в Вконформации при температуре 304 K (∆G0, T = 304 K) составило -29,2 кДж/моль(∆H0 = -44,6 кДж/моль, T∆S0 = -15,4 кДж/моль).
Соответствующая константа диссоциации RpцАМФS из лиганд-белкового комплекса оказалась равной 9,7·10-6М. Энергия π-электронноговзаимодействия, как и в случае агонистов, не учитывалась.Стандартное изменение свободной энергии связывания Rp-цАМФS с B-доменом в Hконформации при температуре 304 K (∆G0, T = 304 K) составило -22,5 кДж/моль(∆H0 = -16,6 кДж/моль, T∆S0 = 5,9 кДж/моль). Соответствующая константа диссоциации RpцАМФS из лиганд-белкового комплекса равнялась 1,4·10-4М.3.4. Квантово-химический анализ параметров водородных связей, образуемыхэкваториальным атомом кислорода (серы) лиганда и амидной группой белкаДля анализа возможных механизмов обратного агонизма Rp-цАМФS (см.
раздел 4.2)потребовалось оценить характеристики водородных связей, образуемых экзоциклическиматомом кислорода или серы и амидной группой белка.Порезультатамквантово-химическихрасчетовдляводороднойсвязимеждуэкзоциклическим атомом кислорода цАМФ и амидной группой белка характерны энергия–7,7 ккал/моль и длина 3,0 Ǻ, определяемая как расстояние между тяжелыми атомами. RpцАМФS тоже образует водородную связь с амидной группой белка, однако такая связь менеевыгодна по энергии (–4,7 ккал/моль) и характеризуется большей длиной (3,9 Ǻ).Как отмечено в разделах 3.2 и 3.3, увеличение длин водородных связей при заменеэкзоциклического атома кислорода атомом серы было получено и при проведении докинга.Таким образом, квантово-химические расчеты косвенно подтверждают справедливость57изложенных выше результатов докинга.3.5 Обсуждение результатов3.5.1.
цАМФ-связывающий сайт А-домена R-субъединицы, находящейся в составе RCкомплекса, может связывать цАМФПри помощи метода докинга нам удалось показать способность А-домена Rсубъединицы ПКА Iα, находящейся в комплексе с С-субъединицей, связывать лиганды.
Этиданные позволили внести ясность в несоответствие между существующей моделью активацииПКА Iα и рядом экспериментальных фактов. Так, согласно искомой модели [4], молекулацАМФ не может связаться с А-доменом R-субъединицы, входящей в состав RC комплекса, покаB-домен не претерпел цАМФ-индуцированных конформационных изменений. Данноеутверждение основано на результатах рентгеноструктурного анализа [4], указывающих навзаимодействие ряда аминокислотных остатков цАМФ-связывающего сайта А домена с Ссубъединицей, и согласуется с установленным порядком связывания цАМФ с доменамиПКА Iα [68].
Однако ему противоречит возможность цАМФ-индуцированной активации RCкомплексов, лишенных B-домена или содержащих в нем препятствующие связыванию цАМФмутации [67, 69]. Единственным возможным механизмом цАМФ-индуцированной активациитаких мутантных комплексов представляется связывание цАМФ с А-доменом R-субъединицы,способствующее переходу последнего в В-конформацию. Результаты докинга делают такоепредположениеправдоподобным.Намибылиопределеныаминокислотныеостатки,участвующие в связывании цАМФ А-доменом, находящимся в H-конформации, и среди этихостатков не оказалось тех, которые взаимодействуют с С-субъединицей.
Кроме того, структурыС-субъединицы не препятствуют попаданию цАМФ в связывающий сайт, хотя и ограничиваютпути его перемещения. Таким образом, принципиальная возможность связывания цАМФ с Адоменом R-субъединицы, входящей в состав RC комплекса, существует. Стоит отметить, что этоутверждение не противоречит данным кинетических исследований [68]. Ведь, дажеэкспериментально подтвержденный факт связывания цАМФ с А-доменом не дает основанияполагать, что такое связывание, в отличие от связывания с B-доменом, инициирует активациюне несущей мутаций ПКА Iα. Действительно, структура А-домена весьма эффективностабилизированамногочисленнымимежбелковымиконтактамисC-субъединицей,затрудняющими движения больших групп атомов.
Напротив, В-домен, если и связан с Ссубъединицей, то только несколькими связями [4, 70]. Поэтому логично предположить, чтонаиболее быстрым путем активации ПКА Iα является связывание цАМФ с B-доменом,приводящее к смещению С-спирали А-домена с поверхности С-субъединицы, и, как следствие,58к ускорению цАМФ-зависимого конформационного перехода А-домена. Прямых доказательствэтой гипотезы пока не существует, однако есть экспериментальные факты, косвенно ееподтверждающие. Так продемонстрировано, что обратный агонист ПКА Iα Rp-цАМФS являетсяслабым агонистом ПКА Iα c заменами аргинина в положении 209 на ряд других остатков [34,64].Какпоказанонамивследующейглаведиссертации,Rp-цАМФSблокируетконформационный переход цАМФ-связывающих доменов из H- в В-конформацию, однакоможет связываться с доменом, находящимся в В-конформации, причем таким же образом, какцАМФ.
Известно, что B-домен ПКА Iα практически не взаимодействует с С-субъединицей ипоэтому часть времени проводит в В-конформации [70]. В то же время вероятность связыванияRp-цАМФS с А-доменом, находящимся в H-конформации, значительно снижена из-за мутацийаминокислотных остатков, взаимодействующих с лигандом. Принимая во внимание всеперечисленные факты, объяснить агонизм Rp-цАМФS можно только допустив, что егосвязывание с B-доменом ускоряет цАМФ-независимый конформационный переход А-домена,который, вероятно, протекает по тому же механизму, что и цАМФ-индуцированный.3.5.2. Rp-цАМФS и Sp-цАМФS могут образовывать стабильные комплексы как со свободнойR-субъединицей, так и с R-субъединицей, входящей в состав RC комплексаПолученные нами данные однозначно свидетельствуют в пользу того, что все трилиганда (цАМФ, Sp-цАМФS и Rp-цАМФS) могут связываться с А- и В-доменами RIα,независимо от конформации последних, причем комплексы, образованные с доменами в Вконформации, характеризуются большей устойчивостью.
Основываясь на этих результатах и натом, что А-домен в составе RC комплекса находится в H-конформации, можно предположить,что активация ПКА Iα в присутствии агонистов протекает преимущественно по путииндуцированного соответствия, а механизм обратного агонизма Rp-цАМФS заключается вблокировании перехода цАМФ-связывающих доменов из H- в В-конформацию. Следуетотметить, что ранее было предложено другое объяснение механизма обратного агонизма RpцАМФS [5], согласно которому Rp-цАМФS действует по пути отбора конформаций, отдавая, вотличие от агонистов, предпочтение H-конформации цАМФ-связывающих доменов.Установление истинных причин обратного агонизма Rp-цАМФS имеет принципиальноезначение для понимания механизма активации ПКА Iα и конформационных переходов цАМФсвязывающих доменов и поэтому должно основываться на неоспоримых экспериментальныхданных.
В то же время полученные нами значения констант диссоциации лигандов из А- и Вдоменов, находящихся в H-конформации, довольно сильно отличаются от экспериментальных.А следовательно, всю проведенную нами количественную оценку можно поставить подсомнение. Чтобы определить истинное положение дел в этом вопросе, мы создали модель,59дающую возможность, опираясь на немногочисленные достоверные экспериментальныеданные, оценить значения всех констант, характеризующих процесс активации ПКА Iα.Описание этой модели дано в приложении Б, а обсуждению полученных оценок посвященраздел 3.5.4.3.5.3. Смещение амидной группы A202(А326) может запускать конформационный переходцАМФ-связывающих доменовПолученные методом докинга данные об отсутствии связи между цАМФ и A202(А326) вH-конформации цАМФ-связывающих доменов представляют собой абсолютно новый научныйрезультат.
На его основании мы предполагаем, что именно смещение амидной группы A202(А326) должно приводить к изменению структуры ФСК, а следовательно, запускатьконформационный переход всего домена.Причины, по которым об этом процессе до сих пор не было известно, вероятно, лежат внеустойчивости комплекса цАМФ-связывающего домена в H-конформации с цАМФ.Связавшись с сайтом, цАМФ сразу индуцирует конформационный переход домена, при этомпроисходит образование искомой водородной связи.
Таким образом, до настоящей работынегласно полагалось, что взаимодействие между амидной группой A202 (А326) и цАМФустанавливаетсясразуприсвязываниицАМФипотомуигратьрольвзапускеконформационного перехода не может. Лишь в последних работах [5], посвященных анализуэлектростатического и гидрофобного «переключателей», допускается, что остаток A202 всетаки принимает участие в функционировании последнего, но только в качестве гидрофобногоокружения цАМФ посредством своей боковой группы совместно с остатками L201, L203 и I204.Если наше предположение о ключевой роли A202 (А326) в конформационном переходецАМФ-связывающих доменов верно, то оно объясняет начальный этап механизма передачиинформации о связывании лиганда на удаленные структуры белка.
Кроме того, можнодопустить, что Rp-цАМФS блокирует переход цАМФ-связывающих доменов из H- в Bконформацию, создавая препятствия смещению амидной группы A202 (А326).Доказательству выдвинутой нами гипотезы посвящены четвертая, пятая и шестая главынастоящей диссертации.3.5.4 Численная оценка значений констант, характеризующих процесс активации ПКА IαКак уже отмечалось выше, полученные нами численные оценки значений константдиссоциации цАМФ из связывающих сайтов А- и В-доменов, находящихся в H-конформации,существенно отличаются от экспериментальных. Однако из таблиц 1.1 и 1.2 следует, что междуэкспериментальными оценками, приведенными в разных работах, также существует много60противоречий. Чтобы понять, какие из имеющихся значений ближе всего к истине, мыпредложили модель активации ПКА Iα. В ее основу легло представление об R-субъединице како конкурентном16 ингибиторе С-субъединицы, препятствующем проявлению ферментативнойактивности последней. Процесс превращения субстрата реакции (пептида кемптида) в продуктпод действием С-субъединицы мы рассмотрели в рамках квазистационарного приближенияМихаэлиса-Ментен.
Описание данной модели и полученные с ее использованием численныеоценки приведены в приложении Б.Значения всех рассматриваемых констант, определенные в рамках модели, (таблицы Б.1и Б.2) согласуются друг с другом и с основными экспериментальными данными, непротиворечат ожиданиям, базирующимся на логических заключениях, а следовательно, могутслужить первым приближением для исследования термодинамических аспектов активации ПКАIα. В этой связи важно отметить, что значения констант диссоциации цАМФ из связывающихсайтов А- и В-доменов, рассчитанные нами в ходе докинга и оцененные с использованиемпредложенной модели, оказались близки друг к другу.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
