Диссертация (1145986), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Как показали предварительные расчеты, в силовом полеCHARMM27 нет параметров, корректно описывающих это взаимодействие, поэтому β2β3петля, несмотря на присутствие R209, в течение первой наносекунды моделирования теряетискомый изгиб и переходит в другую конформацию. Во избежание этого нежелательногоэффекта положение β2β3-петли в течение всего времени моделирования поддерживалось спомощью внешних сил, которые накладывались на атомы основной цепи β2β3-петли (Q164 –F172) и стабильных участков β-субдомена (а. о.
V154 – I163, Y173 – V182, T190 – G195, K214 –I224). Выражение для потенциальной энергии, определяющей накладываемые силы, имело9Здесь и далее будем полагать, что состояние системы зависит только от внутренних координат всех ее атомов, ноне зависит от скоростей этих атомов и положения центра масс системы. Таким образом, исследуемое нами фазовоепространство обладает меньшей размерностью, чем фазовое пространство в строгом смысле, и является, по сути,пространством микроконформаций системы.40следующий вид:U ( RMSD) =1k ⋅ RMSD2 ,2где k – константа “жесткости”, в расчете на один атом равная 4 – 5 ккал/(моль·Ǻ2), аRMSD – среднеквадратичное отклонение текущего положения рассматриваемых атомов от ихположения, наблюдаемого при реализации нативного изгиба β2β3-петли.Из приведенного выражения видно, что наложение сил не только на атомы β2β3-петли,но и на атомы стабильных участков β-субдомена было необходимо для устранения возможностиуменьшения RMSD путем перемещения домена как целого.В системах с мутационной заменой R209K мы использовали эту же методику наложениявнешних сил для поддержания положения боковой цепи K209 близко к нативному положениюR209.
То положение K209, относительно которого рассчитывали RMSD, определялось в ходемоделирования домена без фиксации K209 и выбиралось как наиболее близкое к нативномуположению R209 в связывающем сайте. О каждом случае применения такой фиксации K209сказано отдельно в последующих главах (разделы 5.2.6 и 6).2.3.3. Математическая обработка результатов методом кластерного анализаИз сказанного выше следует, что каждая точка МД траектории представляет собоймикроконформацию исследуемой системы. Если при этом время моделирования настольковелико,чтоколичествоточек-микроконформаций,реализовавшихсядлякаждогоизметастабильных состояний системы, пропорционально устойчивости этих состояний, то ксовокупностиполученныхмикроконформацийможноприменитькластерныйанализ.Выявленные кластеры в общем случае будут соответствовать искомым метастабильнымсостояниям (таким как H- и В-конформации А-домена RIα), средние значения характеристикбелка по кластерам определят свойства и особенности строения этих состояний, а сравнениезаселенностей кластеров позволит оценить относительную устойчивость соответствующих имконформаций.Существует два подхода к кластеризации данных, полученных в ходе МД моделирований[92 – 94].
При геометрической кластеризации, расстояние между микроконформациямипредставляет собой меру различия их пространственного строения. Недостатком этого подходаявляется то, что для некоторых ландшафтов свободной энергии структурно схожиеконформациипринадлежатразнымэнергетическимминимумам,аразличающиесяконформации, напротив, соответствуют в реальности одному метастабильному состоянию. Прикинетической кластеризации расстояние между микроконформациями определяется не ихструктурными особенностями, а частотой переходов между ними. Такой подход гарантирует41выявление истинных метастабильных состояний, но требует гораздо большего массива данных,поэтому на настоящий момент он реализован только для очень маленьких систем.В соответствии с вышесказанным анализ равновесия между конформациями β-субдоменаА-домена RIα был произведен нами путем геометрической кластеризации.
Чтобы снизитьвероятность ошибки, присущей этому методу, мы выделили восемь коллективных переменных,которые в предварительных расчетах показали себя хорошими маркерами для разграничения Hи В-конформаций. Расстояние между микроконформациями было определено в пространствеэтих переменных. Первые две из них, RMSDB(ФСК) и RMSDH(ФСК), представляют собойсреднеквадратичное отклонение положений атомов основной цепи ФСК (а. о. 198 – 211) врассматриваемой микроконформации от положений этих же атомов в B- (PDB ID 1NE6) и H(PDB ID 3PVB) конформациях соответственно (подробнее о функции RMSD – в разделе 2.5.1).Третья переменная описывает энергию взаимодействия остатка L203 с гидрофобным карманом,образованным остатками β2β3-петли – G169, D170 и N171. Как следует из результатов,полученных до проведения кластерного анализа и изложенных в главе 4, упаковывание L203 вэтот карман является обязательной чертой B-конформации.
Четвертая, пятая и шестаяпеременные соответствуют межатомным расстояниям G199(O)–L203(N), G199(O)–A202(N) иA202(O)–T207(N), которые характеризуют водородные связи между атомами основной цепи B`спирали и служат более детальному описанию ее конформации. Седьмая и восьмая переменныепредставлены расстояниями G169(N)–G206(O) и G169(N)–T207(O) (в H-конформации этодлины водородных связей). В совокупности они определяют расстояние между β2β3-петлей иФСК.Кластерный анализ проводили с помощью программы Statistica 10 [95], используя методК-средних и манхэттенское расстояние [96], комбинация которых позволила достигнутьнаилучшего выделения кластеров. Сначала количество кластеров оценивалось путем v-кратнойперекрестной проверки (v-fold cross-validation), встроенной в программу Statistica.
Затемкластеризацию повторяли на этой же совокупности данных, но уже указывая количествокластеров и варьируя положение их начальных центров, благодаря чему были уточнены ихграницы.Для перехода от восьмимерного пространства, в котором производилась кластеризация, кудобному для визуализации двумерному пространству мы следовали методике, предложеннойранее в одной из аналогичных работ [97].
Согласно этой методике в исходном восьмимерномпространстве на той же совокупности данных, что и кластеризация, проводился факторныйанализ по методу главных компонент. Анализируемые данные проецировались на пространствопервых двух главных компонент (PC1 и PC2), имеющих максимальные значения собственныхчисел, а потому характеризующих основную долю дисперсии, свойственную исходному набору42данных. На итоговых двумерных изображениях разные кластеры окрашивались в разные цвета.Каждый полученный кластер предположительно представлял собой метастабильнуюконформацию β-субдомена, характеризовался заселенностью (долей всех точек-микроконформаций, приходящихся на этот кластер) и описывался средними по кластеру значениями восьмивыбранных переменных. По этим восьми признакам выделенные кластеры сравнивались междусобой с использованием пакета программ SPSS10 [98].Сначала было произведено сравнение между кластерами, соответствующими одним итем же конформациям в разных исследуемых системах.
Целью такого анализа было выявлениевариаций пространственной структуры β-субдомена в пределах одной конформации взависисмости от свойств остатка в 209-ом положении и наличия/отсутствия лиганда всвязывающем сайте. Из-за большого размера выборки (15 000 – 150 000 точек-микроконформаций для каждой системы) все различия между кластерами оказались статистическизначимыми.
Тем не менее за этой значимостью не было видно реальных физических различий.Таким образом, мы предположили, что остаток в положении 209 и лиганд в связывающем сайтене оказывают влияния на структуру конформаций β-субдомена и, основываясь на этом,усреднили кластеры (средние по кластерам значения каждой из восьми переменных),соответствующие одинаковыми конформациями во всех рассматриваемых системах.
Затем былиисследованы различия между разными конформациями, представленными усредненными напредыдущем этапе кластерами. Это задача выполнялась с использованием одномерногооднофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). По результатам его проведения дляизучения различий между конформациями по каждой из переменных средние значения этихпеременных сравнивались попарно при помощи теста наименьшей значимой разности (LSD,least significant difference).2.4. Изучение H→→B конформационного перехода А-домена ПКА IααДля исследования перехода А-домена RIα из H- в В-конформацию и определения ролигидрофобного «переключателя» в его протекании (третья и четвертая задачи диссертации,названные в разделе Введение, стр. 8) было предпринято моделирования целого А-домена,включающего в себя как β-, так и α-субдомен.2.4.1.
Подготовка А-доменаПодготовка А-домена RIα (а. о. 118 – 242) к моделированию его конформационногоперехода проводилась так же, как и подготовка соответствующего ему β-субдомена (раздел10Обработка результатов по описанной далее в разделе 2.3.3 методике выполнялась при участии Вершининой Е.А.,что нашло отражение в совместной публикации.432.3.1).
Единственное различие состояло в том, что среди всех систем, несущих мутационныезамены R209, в этом эксперименте была оставлена только система с заменой R209K. Наосновании данных о ее конформационных изменениях предполагалось сделать окончательныевыводы о роли электростатического «переключателя» R209–D170–R226 в переходе А-домена изH- в В-конформацию.2.4.2. Моделирование H→B конформационного перехода А-домена ПКА Iα методамимолекулярной динамики2.4.2.1 Методика моделирования H→B конформационного перехода А-домена RIαМоделирование перехода А-домена RIα из H- в В-конформацию проводилось методамиклассической и ускоренной МД (об ускоренной МД – раздел 2.4.2.2) с использованиемпрограммы NAMD 2.8 [87].
Параметры силового поля, растворитель, граничные условия, шагинтегратора и алгоритм минимизации энергии перед постановкой МД использовались те же,что и при моделировании отдельного β-субдомена (раздел 2.3.2). Кроме того, в соответствии сизложенной в разделе 2.3.2 методикой и исходя из названных там причин, положение β2β3петли А-домена (а также положение боковой цепи K209 в системе с мутационной заменойR209K) в течение всего времени моделирования поддерживалось с помощью внешних сил.Всего было получено тринадцать траекторий, представляющих собой пути перехода Адомена из H- в В-конформацию (из них двенадцать для домена белка дикого типа и одна длядомена с мутационной заменой R209K).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
