Диссертация (1145986), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Так, например, N6-фенил-цАМФ (агонист всехизоформ ПКА) имеет повышенную аффинность к А-доменам ПКА (в 18 и 40 разпревышающую аффинность цАМФ для RI и RII субъединиц соответственно), меньшую в двараза по сравнению с цАМФ аффинность к В-доменам ПКА и является антагонистом белкаEPAC [61, 30].20Рисунок 1.4 – Нумерация атомов в цАМФ согласно номенклатуре IUPACСледующие закономерности можно назвать общими для взаимодействия лигандов сцАМФ-связывающими доменами всех изоформ протеинкиназ А:1) ароматическое кольцо и гидрокси-группа в 2`-положении важны для связывания лиганда с Аи В- сайтами. Показано, что 2`-дезокси-аналоги цАМФ как активаторы ПКА Iα в 4000 разслабее цАМФ [62], а лиганды, лишенные ароматического фрагмента, на настоящий момент неизвестны. Причем не только производные пуринов или пиримидинов могут активировать ПКА:подобнымжесвойствомобладаетTzMP,несущийвместоазотистогооснованиятиазолкарбоксамид [63].2) модификации азотистого основания, повышающие электронную плотность на атомах C6–N1–C2, уменьшают аффинность лигандов к связывающим сайтам всех изоформ ПКА.Предположительно этим свойством объясняется высокая (в 100 – 1000 раз) селективность ПКАпо отношению к цАМФ в сравнении с цГМФ [61].3) модификации азотистого основания, вызывающие смещение электронной плотности с С2 наС8, благоприятствуют связыванию лиганда с B-сайтом RI субъединицы, но делают невыгоднымего взаимодействие с А-сайтами всех изоформ ПКА [61].4) Лиганды, имеющие объемные заместители у атомов N6 и С8, отличаются повышеннымсродством соответственно к А- и В-сайтам ПКА.
Крупные фрагменты у атома С2 всегдаприводят к пониженной аффиности лиганда к А-сайту, а на связывание с В-сайтом наличиеобъемного заместителя в этом положении не оказывает влияния [61].Особый интерес представляют серузамещенные аналоги циклических нуклеотидов, укоторых атом серы занимает положение одного из экзоциклических атомов кислородафосфатного кольца O6 или O7 [5, 7, 27]. Sp-диастереомерные аналоги, у которых замещен атомкислорода O7, (например, Sp-цАМФS) являются агонистами протеинкиназ А, хотя и отличаютсяменьшей аффинностью к связывающим сайтам, чем соответствующие незамещенные лиганды21[64]. Rp-диастереомерные аналоги, у которых замещен атом кислорода O6, (например RpцАМФS) проявляют себя как обратные агонисты ПКА, понижая константу диссоциации RCкомплекса примерно на порядок по сравнению со спонтанной [65].
Аналогичное действие Rpаналоги оказывают на белок EPAC [66]. Точный механизм обратного агонизма Rpдиастереомеров циклических нуклеотидов на настоящий момент не известен. Предполагается,что они имеют повышенное сродство к H-конформации цАМФ-связывающих доменов, а такжеблокируют конформационный переход последних путем разобщения электростатического«переключателя» [5, 65]. Тем не менее методом рентгеноструктурного анализа показано, чтопри определенных условиях Rp-цАМФS формирует комплексы с RIα субъединицей,представленные ее B-конформацией [27].
Кроме того, в случае с ПКА Iα существует по крайнеймере две группы условий эксперимента, при которых Rp-аналоги циклических нуклеотидовявляются слабыми агонистами протеинкиназы А. Первая группа условий связана с подборомконцентраций субстрата и Rp-аналога (например Rp-цАМФS): субстрат должен быть в избытке[34], а концентрация Rp-цАМФS относительно мала (прим.
автора диссертации). Вторая группаусловий включает в себя необходимость наличия в цАМФ-связывающем сайте А-доменамутаций, препятствующих связыванию лиганда [34, 64]. Эти факты должны иметьисключительное значение для понимания роли циклических нуклеотидов в механизмеинициации конформационных изменений АМФ-связывающих доменов.1.4. Диссоциация RIαα:C комплекса при цАМФ-индуцированной активации ПКА IααМинимальным фрагментом RIα, обладающим способностью формировать стабильныйкаталитически неактивный и при этом активируемый цАМФ RC комплекс, является RIα (а. о.
94– 235) [67]. В него входит ингибиторный пептид и весь А-домен RIα, за исключением Сспирали. Структуры RC комплексов, содержащих весь А-домен, RIα(91–244):C4 (PDB ID 3FHI)[28], или оба цАМФ-связывающих домена, RIα(91–379):C (PDB ID 2QCS)5 [4], были впервыерасшифрованы в 2005 и 2007 годах. Результатом этих исследований стало выделение встабилизирующих RC комплекс контактах четырех сайтов связывания (рисунок 1.5). Первыедва из этих сайтов присутствуют в минимальном RIα(93–235):C комплексе, первые три – вкомплексе RIα(93–260):C, а благодаря четвертому сайту с С-субъединицей оказывается связанB-домен RIα.4Здесь и далее такая форма записи используется для обозначения RC комплексов, для которых указано, какойфрагмент R-субъединицы участвует в их образовании.
Диапазон остатков этого фрагмента приведен в скобках.5В структуре 2QCS B-домен несет мутацию инвариантного остатка R333, участвующего в связывании цАМФ(R333K). Получить структуру комплекса RIα(91–379):C дикого типа до сих пор не удалось.22В основу рисунка положены данные рентгеноструктурного анализа (PDB ID 2QCS) [4]. C-субъединица показанаповерхностью серого цвета, RIα субъединица – бирюзовыми лентами. Желтым цветом обозначен первый сайтсвязывания R- и С-субъединиц, малиновым – второй, синим – третий, коричневым – четвертый. В цАМФсвязывающие сайты А- и В-доменов путем выравнивая пространственных структур RIα в B- и H-конформациях(подробнее раздел 2.5.1) помещены молекулы цАМФ (цАМФА и цАМФВ для А- и В-сайтов соответственно)Рисунок 1.5 – Строение комплекса RIα(91–379):C с мутацией R333K в В-доменеПервый сайт связывания (выделен желтым цветом на рисунке 1.5) включает в себяаминокислотные остатки, обеспечивающие взаимодействие ингибиторного пептида RIα (а.
о. 94– 98) с активным сайтом С-субъединицы. Это взаимодействие характерно для всех субстратов ипсевдосубстратов ПКА, и его разрушение не является цАМФ-зависимым процессом [4, 42].Второй сайт связывания (показан малиновым цветом на рисунке 1.5) образован состороны R-субъединицы N3A-мотивом и ФСК А-домена. Ключевым взаимодействием при этомявляется водородная связь Y247(С-субъединица)–Y205(R-субъединица), поддерживаемая рядомконтактов между гидрофобными остатками ФСК и С-субъединицы.
Исходя из участия в этомблоке контактов ФСК А-домена, было предположено [4], что цАМФ-связывающий сайт Адомена в составе RC комплекса недоступен для лиганда и связывает его только послеконформационных изменений B-домена. Такая гипотеза подтверждается данными исследованияА- и В-сайтов RC комплекса [68], свидетельствующими в пользу связывания цАМФ сначала сB-, а только потом с А-доменом. Однако ей противоречит возможность цАМФ-индуцированнойактивацииRCкомплексов,лишенныхB-доменаилисодержащихв неммутации,препятствующие связыванию цАМФ [67, 69].В третьем сайте межсубъединичных контактов (выделен синим цветом на рисунке 1.5)23задействованы со стороны R-субъединицы в основном аминокислотные остатки B/C-спирали Адомена. Также в него входит часть линкерного участка (а.
о. 99 – 106) и А-спираль B-домена (Сконцевая спираль N3A-мотива). Особо стоит отметить остаток W260, который в цАМФсвязанной форме R-субъединицы играет роль кэпа А-домена, а в RC комплексе фиксирован наповерхности С-субъединицы [4] на расстоянии около 40Å от соответствующей ФСК. Изменениеего положения при переходе R-субъединицы из H- в В-конформацию показывает масштабностьконформационных перестроек последней.Наконец, четвертый сайт (обозначен коричневым цветом на рисунке 1.5) включает в себясвязи, образованные со стороны R-субъединицы аминокислотными остатками В-спирали Вдомена.
Имеются данные (полученные методом малоуглового рассеяния), свидетельствующие впользу стабильности этого сайта только у RC комплекса с мутационной заменой R333K [70]. Убелка дикого типа соответствующие связи то образуются, то разрушаются, что приводит ксуществованию RC комплекса в виде ансамбля конформаций с неопределенным положением Вдомена.
С этим фактом, видимо, связаны неудачи в получении кристаллической структурыкомплекса RIα(91–379):C дикого типа [4].Диссоциация RC комплекса сопровождается разрывом всех четырех сайтов связыванияи, если речь идет о цАМФ-индуцированной активации ПКА Iα, то переходом RIα в Bконформацию.Важное дополнение к приведенному структурному описанию дают значения константактивации и диссоциации RC комплексов, R-субъединицы которых несут разнообразныеделеции [67].
Интересно, что значения констант активации таких комплексов изменяютсянелинейно при увеличении фрагмента RIα. Так, значение константы активации RIα(93–235):Cкомплекса приблизительно в 2 раза выше, чем у комплекса, образованного с участием RIαдикого типа. Включение С-спирали А-домена в состав фрагмента RIα (комплекс RIα(94–244):C)приводит к возрастанию константы активации еще в 3–4 раза. А если фрагмент RIα содержиттакже А-спираль B-домена (комплекс RIα(93–259):C), то значение константы активациисоответствующего комплекса превышает значение для комплекса дикого типа уже на порядок. Сдругойстороны,значенияконстантцАМФ-независимойдиссоциациирассмотренныхкомплексов всегда уменьшаются с ростом фрагмента RIα, что хорошо согласуется ссопровождающим этот рост увеличением числа сайтов связывания между R- и Ссубъединицами [67].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
