Диссертация (1145986), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Сродство Ссубъединиц к R-субъединицам в цАМФ-связанной форме недостаточно для поддержаниястабильности RC комплекса, и он диссоциирует в присутствии субстрата, освобождаякаталитически активные C-субъединицы [1 – 3, 42, 43].Другим хорошо известным ингибитором активности С-субъединиц ПКА является пептид12ПКИ (ингибитор протеинкиназы А). Он отличается от R-субъединиц меньшим сродством к Cсубъединице, а также тем, что диссоциация каталитически неактивного комплекса,образованного с его участием, происходит независимо от цАМФ [3].Но не только С-субъединицы, R-субъединицы также могут функционировать каксамостоятельные белки.
Так, RIα субъединица, помимо поддержания неактивного состоянияПКА, участвует в инактивации цитохромоксидазы [9], образует комплексы с mTOR киназой[10], рибосомальной S6 киназой 1 (RSK1) [11] и Smad3/Smad4 комплексом [12], контролируеттранспорт факторов транскрипции (PATZ1) [13] и репликации (RFC40) [14] в ядро, причемнекоторые из этих процессов регулируются цАМФ.Все приведенные факты в совокупности позволяют говорить об R- и C-субъединицах како независимых белках, исторически получивших не совсем корректные названия. А описаниемеханизма цАМФ-индуцируемых конформационных изменений R-субъединиц становитсяважно не только для понимания активации ПКА, но и для объяснения функционированиядругих белковых комплексов.1.2. Доменная структура RIαα субъединицы1RIα субъединица представляет собой белок массой 490 кДа и имеет по ходуаминокислотной последовательности следующие структуры (рисунок 1.1): домен димеризации(а.
о. 12 – 60), линкерный участок (а. о. 61 – 120) и два последовательных цАМФ связывающихдомена, А (а. о. 121 – 244) и В (а. о. 245 – 379) [1, 44, 45].На рисунке представлены: домен димеризации (D/D Domain), ингибиторная последовательность (Inhibitor Site) ицАМФ-связывающие домены А и В (cAMP Binding Domains: A-domain, B-domain). Рисунок взят из [44]Рисунок 1.1 – Доменная структура регуляторной субъединицы ПКА IαДомены димеризации двух R-субъединиц формируют стабильную структуру типабочонка (4 helix bundle), приводя таким образом к образованию регуляторного димера.Строение такого димера способствует реализации межмолекулярных контактов между цАМФсвязывающими А-доменами, благодаря чему во взаимодействии цАМФ с одноименнымисайтами связывания и в цАМФ-зависимой активации ПКА появляется положительная1Данная работа посвящена ПКА Iα, поэтому в обзоре литературы будет рассматриваться только Iα изоформа R-субъединицы13кооперативность [46].
Важно отметить, что об этой кооперативности можно судить позначениям коэффициента Хилла, в отличие от положительной кооперативности между А- и Bдоменами в пределах одной R-субъединицы. Последняя маскируется разным сродством А- и Всайтов к цАМФ и может быть обнаружена только с применением сайт-специфических аналогов.Собственно значения констант связывания R-субъединицы с цАМФ или С-субъединицей малозависят от присутствия домена димеризации, поэтому часто в экспериментальных работахвместо RIα субъединицы используют ее делеционный мутант (∆1-91)RIα [47].Помимо обеспечения существования R-субъединиц в форме димера важной функциейдомена димеризации является то, что он несет сайты связывания других белков, в том числеAKAPs [48].
Таким образом, домен димеризации принимает непосредственное участие вфиксации ПКА на поверхности мембраны и в образовании многофункциональных белковыхкомплексов.Линкерный участок, следующий за доменом димеризации, – самый конформационнонестабильныйфрагментR-субъединицыПКА.ОднакоприсутствиеC-субъединицыспособствует формированию в нем элементов вторичной структуры [48].Часть линкерного участка представлена ингибиторным пептидом (94 – 98), имеющимвидпсевдосубстратной(дляRIизоформ)илисубстратной(дляRIIизоформ)последовательности [49].
Ингибиторный пептид взаимодействует с активным сайтом Cсубъединицы и имеет решающее значение для формирования стабильного RC комплекса. В егоотсутствие R- и С-субъединицы не взаимодействуют друг с другом [47]. И напротив, еслиингибиторный пептид имеется, то связь между ним и С-субъединицей не разрывается даже вприсутствии цАМФ, а происходит конкурентное вытеснение R-субъединицы субстратом всоответствии с законом действующих масс [42, 43].Помимо ингибиторного пептида, в линкерном участке есть сайты связывания другихбелков, например, пролин направляемых киназ или белков, несущих SH3 домены [48].
Такимобразом, линкерный участок наравне с доменом димеризации принимает участие вформировании межбелковых комплексов.Следом за линкерным участком, если двигаться от N-конца R-субъединицы к С-концу,расположены два последовательных цАМФ-связывающих домена, гомологичных друг другу, ноимеющих каждый свои особенности строения.
При связывании цАМФ оба доменапретерпевают схожие конформационные переходы, благодаря которым сродство R- и Ссубъединиц друг к другу существенно ослабевает [1, 3, 5]. Этот процесс настолько важен дляпонимания функционирования ПКА и других белков, с которыми R-субъединица формируетцАМФ-зависимые комплексы, что мы решили вынести рассмотрение цАМФ-связывающихдоменов в самостоятельный раздел обзора литературы.141.3. цАМФ-связывающие домены1.3.1.
Строение цАМФ-связывающих доменовДомены,связывающиециклическиенуклеотиды(цАМФицГМФ),широкопредставлены в протеомах разнообразных организмов. Они входят в состав транскрипционныхфакторов прокариот (CAP и другие) [15 – 18], HCN каналов (собственно HCN [19] и spIH [20]),CNG каналов [21], белков EPAC [22, 23], протеинкиназ А [24] и Г [25, 26], а также присутствуютв ряде других белков, функции которых пока не известны [50]. Строение цАМФ-связывающихдоменов в двух присущих им конформациях (H и B) показано на рисунке 1.2 на примере Адомена R-субъединицы ПКА Iα.А.Б.А – H-конформация; Б – B-конформация.
Бирюзовым цветом показан β-складчатый субдомен (кроме ФСК и β2β3петли), фиолетовым – β2β3-петля, желтым – ФСК, розовым – N3A-мотив, пурпурным – B/C-спираль в Hконформации и B- и С-спирали в В-конформации. Показан цАМФ в связывающем сайте.В основу рисунка положены данные рентгеноструктурного анализа (PDB ID 3PVB и 1NE6 для H- и В-конформацийсоответственно) [29, 27]Рисунок 1.2 – Третичная структура цАМФ-связывающего домена RIα на примере А-доменаОбе конформации в отсутствие каких-либо внешних факторов находятся в состоянииравновесия друг с другом, причем доля каждой из них зависит от конкретного домена [30, 31].Если в системе присутствует агент, стабилизирующий одну из конформаций, то равновесие,очевидно, смещается в ее сторону.
Так, для всех цАМФ-связывающих доменов агентами,стабилизирующимиB-конформацию, являютсяцАМФилидругие агонисты цАМФ-связывающих белков. А H-конформацию А-домена RIα делает устойчивой присутствие Ссубъединицы [31].В третичной структуре цАМФ-связывающих доменов выделяют два субдомена: βскладчатый и α-спиральный. β-субдомен, обладает укладкой типа «рулет с джемом» (jelly roll),но в отличие от классического «рулета» содержит короткую B`-спираль между β6 и β7 тяжами[45, 51]. Эта спираль является основой лиганд-связывающего сайта.
За исключением нее, β-15субдоменмалоподверженконформационнымизменениям.α-субдомен,напротив,конформационно подвижен. Он состоит из N3A-мотива (N-спираль, 310-спираль, А-спираль),предваряющего β-субдомен, и двух С-концевых B- и С-спиралей, способных в некоторыхдоменах (например, А-доменах R-субъединиц ПКА) формировать единую B/C-спираль [45]. Воснове конформационного перехода цАМФ-связывающих доменов лежит передача информациио связывании лиганда с β-субдомена на α-субдомен, что сопровождается существеннойперестройкой последнего.
Конкретный механизм этого процесса пока мало изучен.В соответствии с данными, полученными в лаборатории Сьюзен Тэйлор [45],конформационныепереходыцАМФ-связывающихдоменовосуществляютсязасчетвзаимодействия четыре консервативных надвторичных структур: фосфат-связывающей кассеты(ФСК), β2β3-петли, B/С-спирали и N3A-мотива (рисунок 1.2). Первые две из них входят всостав β-субдомена, а вторые, как уже упоминалось, расположены в α-субдомене.Под названием «фосфат-связывающая кассета» (ФСК) объединены С-конец β6 тяжа,N-конец β7 тяжа и B`-спираль между ними F198 – A211 (F322 – A335)2 [24, 45], обозначенныена рисунке 1.2 желтым цветом. Аминокислотные остатки, входящие в состав ФСК, образуютводородные связи с сахаро-фосфатной частью цАМФ, что и дало название этой структуре.Методом рентгеноструктурного анализа установлено [6, 27], что в В-конформации водородныесвязи с цАМФ образует пять аминокислотных остатков ФСК G199 (G323), E200 (E324),A202 (A326), R209 (R333) и A210 (A334), причем все они являются инвариантными.Строение B`-спирали ФСК зависит от конформации домена.
В H-конформации онапредставлена 310-спиралью G199 – I204 (E324 – L328) [4], а в В-конформации вместо нее реализуется более длинная α-спираль G199 – G206 (G323 – N330) [6, 27].Под ФСК расположен второй консервативный участок цАМФ-связывающих доменов –β2β3-петля (петля между β-слоями под номерами 2 и 3), представленная последовательностьюI163 – N171 (V281 – E289) [45]. На рисунке 1.2 она выделена фиолетовым цветом. Согласно существующим данным G169 (G287), входящий в состав этой петли, образует CH-πвзаимодействие с гуанидиновой группой R209 (R333) [52], что имеет существенное значениедля конформационного перехода цАМФ-связывающих доменов. Второй значимый остатокβ2β3-петли D170 образует в B-конформации ионную связь с R209 [53].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
