Диссертация (1145986), страница 2
Текст из файла (страница 2)
986.2. Общая характеристика стадий и событий перехода А-домена из H- в B-конформацию .. 996.3. Описание событий конформационного перехода А-домена из H- в B-конформацию .... 1036.3.1. События, в основе которых лежит конформационное изменение ФСК............................. 1036.3.2. События, в основе которых лежит конформационное изменение N3A-мотива ................
1056.3.3. События, в основе которых лежит конформационное изменение B/C-спирали ............... 1066.4. Описание первого приближения к пути минимальной свободной энергии (ПМСЭ)перехода А-домена из H- в B-конформацию............................................................................... 1116.5.
Обсуждение результатов ........................................................................................................ 11356.5.1 Связь изложенных результатов с существующими экспериментальными и расчетнымиданными ..............................................................................................................................................
1136.5.2. Применимость полученных результатов к другим цАМФ-связывающим доменам......... 1166.6. Промежуточные выводы ........................................................................................................ 124ЗАКЛЮЧЕНИЕ .............................................................................................................................. 126ВЫВОДЫ ........................................................................................................................................ 130СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................................................................
131СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................................. 133ПРИЛОЖЕНИЕ А ..........................................................................................................................
142ПРИЛОЖЕНИЕ Б........................................................................................................................... 149Б.1 RAC комплекс ........................................................................................................................... 149Б.1.1. Схема процессов и постановка задачи................................................................................... 149Б.1.2 Определение равновесных констант Kd1, Kd2, Kd3 и Kd4 ..................................................... 150Б.1.3. Уравнение Михаэлиса-Ментен................................................................................... 150Б.1.4. Определение концентраций [CS] и [C] в системе.................................................................
151Б.1.5. Установление соотношения между концентрациями отдельных компонентов системы 151Б.1.6. Определение концентрации цАМФ ([cAMP])....................................................................... 152Б.1.7. Определение концентраций [R], [RcAMP], [RC] и [RCcAMP] ........................................... 153Б.1.8. Возможные варианты строения комплекса RCcAMP и физический смысл констант Kd1 иKd2 ........................................................................................................................................................
153Б.1.9. Количественная оценка констант Kd1, Kd2, Kd3 и Kd4 ...................................................... 157Б.1.9.1. Комплекс RAC WT .................................................................................................... 157Б.1.9.2. Комплекс RAC M234A ..............................................................................................
158Б.1.9.3. Комплекс RABC R333K ............................................................................................. 160Б.1.9.4. Комплекс RABC R209K ............................................................................................. 162Б.2. RABC комплекс ........................................................................................................................ 163Б.2.1. Схема процессов и постановка задачи................................................................................... 163Б.2.2 Вывод соотношений для оценки равновесных констант ...................................................... 166Б.2.3.
Определение концентрации компонентов системы ............................................................. 167Б.2.4. Количественная оценка равновесных констант и Kакт ......................................................... 167ПРИЛОЖЕНИЕ В .......................................................................................................................... 1716ВВЕДЕНИЕАктуальность темы исследования. Протеинкиназа А (ПКА) – ключевой белокмножества сигнальных каскадов.
Известно его участие в дифференцировке клеток, развитиииммунного ответа, контроле путей метаболизма и многих других процессах [1, 2]. Ферментативную активность ПКА обеспечивают ее каталитические субъединицы (С-субъединицы), анеактивное состояние C-субъединиц достигается путем образования комплексов с рядомпептидов и белков. Наиболее изученными и, видимо, наиболее распространенными являютсяRC комплексы – комплексы С-субъединиц с белками, известными как регуляторныесубъединицы ПКА (R-субъединицы). RC комплекс, образованный с участием RIα изоформы Rсубъединицы, носит название ПКА Iα [1 – 3].Важное свойство всех RC комплексов состоит в том, что они диссоциируют вприсутствиивнутриклеточногомессенджера,циклическогоаденозин-3':5'-монофосфата(цАМФ), на свободные R- и С-субъединицы, что приводит к активации ПКА [3].
ПричинацАМФ-зависимой диссоциации RC комплексов заключается в том, что в состав всех изоформ Rсубъединиц входят два цАМФ-связывающих домена (А-домен и B-домен), каждый из которыхможет существовать в двух конечных конформациях: цАМФ-связанной B-конформации иреализующейся в составе RC комплекса H-конформации [4 – 6].
При связывании цАМФ обадомена претерпевают переход из H- в В-конформацию, благодаря чему контакты между R- и Ссубъединицами ослабевают [4, 5]. Понимание механизма конформационных изменений цАМФсвязывающих доменов, важно для решения ряда биологических задач.Так, циклические нуклеотиды играют ключевую роль в терапии различных заболеваний.Известно, что аналог цАМФ, Rp-цАМФS, и его производные являются эффективнымиингибиторами ПКА Iα [7], а следовательно, могут использоваться для лечения патологическихсостояний, при которых путь цАМФ/ПКА Iα гиперакитивирован.
Одним из примеров такихсостояний являются ВИЧ-инфекции. В данном случае гиперактивация ПКА Iα приводит кугнетению T-клеточного ответа, а введение Rp-цАМФS и его производных восстанавливаетпролиферацию T-клеток [8]. Понимание процесса цАМФ-индуцированной активации ПКА Iαмогло бы не только ускорить получение клинического препарата, но и позволило бы сделатьего максимально эффективным.Кроме того, известно, что RIα субъединица, помимо поддержания неактивного состоянияПКА, участвует в инактивации цитохромоксидазы [9], образует комплексы с mTOR киназой[10], рибосомальной S6 киназой 1 (RSK1) [11] и Smad3/Smad4 комплексом [12], контролируеттранспорт факторов транскрипции (PATZ1) [13] и репликации (RFC40) [14] в ядро, причемнекоторые из этих процессов регулируются цАМФ.
Установление механизма конформационныхпереходовR-субъединицылежитвосновеописанияструктурыиобъяснения7функционирования этих белковых комплексов, а также прогнозирования взаимодействия Rсубъединицы с другими белками.Наконец, цАМФ-связывающие и родственные им домены широко представлены впротеомах разнообразных организмов. Они входят в состав транскрипционных факторовпрокариот (в том числе активируемых и не циклическими нуклеотидами) [15 – 18], HCNканалов (собственно HCN [19] и spIH [20]), CNG каналов [21], белков EPAC [22, 23], протеинкиназ А [24] и Г [25, 26].
Описание конформационного перехода любого из этих доменовсущественно для понимания функционирования всех названных белков, а также для решенияпрактических задач, связанных с регуляцией их активности.Объектом исследования является цАМФ-связывающий А-домен ПКА Iα.Предметом исследования является механизм перехода этого домена из H- в Вконформацию.Степеньразработанностипроблемы.Насегодняшнийденьрасшифрованыкристаллические структуры цАМФ- [6] и Rp-цАМФS-связанных [27] R-субъединиц (в томчисле и отдельного цАМФ- и Rp-цАМФS-связанного А-домена RIα [5]), свободного А-доменаRIα и каталитически неактивного комплекса R- и С-субъединиц [4, 28, 29]. Методом ЯМРпродемонстрировано, что изолированные цАМФ-связывающие домены в отсутствие внешнихфакторов находятся в состоянии динамического равновесия между H- и В-конформациями [30,31].
Способность ряда белков и низкомолекулярных соединений (в том числе цАМФ) влиять наположение искомого равновесия и скорость его достижения лежит в основе выполнения всехбиологических функций цАМФ-связывающих доменов.Для объяснения механизма перехода этих доменов (и в частности А-домена RIα) изоднойконформациивдругуюбылипредложенымоделидвух«переключателей»:электростатического (R209–D170–R226) [5, 32] и гидрофобного (L203–Y229) [30, 33]. Модельгидрофобного «переключателя» подтверждена экспериментально [33], но остается неизвестныммеханизм, посредством которого этот «переключатель» приводится в действие связываниемцАМФ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
