Диссертация (1145986), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Среднее ее значениесоставляет 2,5·10-7M (Таюлица 1.1), если не учитывать выпадающее из общего ряда данныхзначение 1,6·10-7M, полученное в работе [43]. Согласно имеющимся в литературе данным, RABCкомплекс, связанный с двумя молекулами цАМФ, не может быть далее активирован ираспадается на свободные R- и С-субъединицы в соответствии с законом действующих масс.Очевидно, что интенсивность этого процесса повышается в присутствии субстрата,конкурирующего за каталитический сайт С-субъединицы.Среднее значение константы диссоциации RABC комплекса, B-домен которого занятцАМФ, в первом приближении можно принять равным 6,0·10-9M (таблица 1.1).
Таким образом,RABC комплекс с цАМФ-связанным B-доменом оказывается лишь немного слабее RACкомплексов с мутационными заменами R226A, L233A и M234A. Это соотношение междустабильностяминазванныхкомплексовполностьюсоответствуеттеоретическимпредставлениям об их строении (см. выше), а потому принятое приближение представляетсяразумным.Данные о значении константы диссоциации RABC комплекса, A-домен которого занятцАМФ,представляютсянам недостоверными.Авторы работы [72],опубликовавшиеединственное приведенное в таблице 1.1 значение (∼1,0·10-9M), приводят его мимоходом безуказания на метод и говорят о том, что значение получено приближенно. В то же время, еслиследовать логическим предположениям, константа диссоциации такого комплекса должна малоотличаться от константы диссоциации комплекса RAC в присутствии цАМФ, а следовательнодолжна быть порядка 6,0·10-8M.1.6.2.2.
Константы диссоциации цАМФ из цАМФ-связывающих сайтов R-субъединицыЗначения константы диссоциации цАМФ из цАМФ-связывающих сайтов R-субъединицызависят от того, входит ли R-субъединица в состав RC комплекса или находится в свободномсостоянии.Существует очень небольшое количество работ, в которых проводились измеренияконстанты диссоциации цАМФ из связывающих сайтов RC комплекса. При этом только в однойиз них [72] измерения велись в присутствии избытка С-субъединиц, препятствующих по законудействующих масс окончательной диссоциации R- и С-субъединиц. С другой стороны,мутационные замены, используемые в этой работе [72] для инактивации неисследуемого сайта33(G323E и G199E), не изучены хорошо на предмет стопроцентной гарантии инактивации.
Такимобразом, достоверных данных о значениях констант диссоциации цАМФ из связывающихсайтов RC комплекса, на настоящий момент не существует.Тем не менее в качестве первого приближения мы усреднили приведенные в таблице 1.1данные и получили значения >1,5·10-6M и 6,0·10-7M для констант диссоциации цАМФ из А- и Bдоменов соответственно.
Стоит отметить, что как бы ни была велика ошибка этой оценки,значение для B-домена все же должно быть ближе к истине, чем для А-домена. Судя помногочисленным экспериментальным данным, А-домен в составе RC комплекса связываетцАМФ гораздо слабее, чем B-домен, и, следовательно, пренебрегая этим связыванием, мывносим гораздо меньшую погрешность в константу для B-домена, чем если будем пренебрегатьсвязыванием цАМФ с B-доменом и измерять константу для А-домена.Значение константы диссоциации цАМФ из А-домена свободной R-субъединицы зависитот того, может ли остаток W260 образовать стэкинг-взаимодействие с ароматическим кольцомлиганда. Делеционные мутанты R-субъединицы R(93–259) и R(1–259) лишены этого остатка.Точечный мутант RAB(1–379) R333K остатком W260 обладает, однако не может правильно егоориентировать в пространстве, так как для этого необходим цАМФ, связанный в В-домене8.
Врезультате все три мутанта связывают цАМФ достаточно слабо: средняя константа диссоциациицАМФ (таблица 1.1) равна 1,2·10-7M. Присутствие остатка W260 и возможность его правильноориентировать в пространстве уменьшают константу диссоциации цАМФ из А-доменасвободнойR-субъединицы.Втакомслучаееезначениеможнопринятьравным 5,6·10-8M (таблица 1.1).Ввиду большого разброса данных мы не стали усреднять значения константыдиссоциации цАМФ из B-домена свободной R-субъединицы.
Конкретное значение константы,справедливое хотя бы в качестве первого приближения, на данный момент остается неопределенным.Как будет продемонстрировано в приложении Б (раздел Б.2.1), оценка средних значенийконстант диссоциации цАМФ, характеризующих связывание цАМФ с обоими доменами,представляется спорной как для RC комплекса, так и для свободной R-субъединицы.
Исходя изэтого, мы не рассматривали соответствующие экспериментальные данные и не использовали ихпри анализе наших результатов.8Правильней рассматривать мутантную субъединицу RAB(1–379) R333K, как имеющую среднее сродство к цАМФсреди субъединиц, создающих и не создающих правильную ориентацию ароматического кольца W260. Однако всвязи с ограниченными экспериментальными данными мы в первом приближении усреднили значения константыдля трех названных комплексов. В перспективе для более точных оценок необходима корректировка сделанныхприближений.341.6.2.3.
Константы активации RC комплексаОпределение средних значений констант активации RC комплексов представляет собойдостаточно сложную задачу, несмотря на обилие экспериментальных данных (таблица 1.2).Дело в том, что все измерения проводились при разных концентрациях белка и субстрата, аиногда и при разных температурах, причем часто авторы не указывают все условияпроводимого опыта, вынуждая таким образом последующих исследователей отказываться отиспользования их данных.
Тем не менее мы решили использовать все имеющиесяэкспериментальные данные, беря, однако, вместо среднего значения константы диапазонзначений. Так, для комплекса RABC WT искомый диапазон покрывает значения от 0,8·10-7M до2,0·10-7M. Для комплекса RAC WT истинное значение константы активации лежит в пределах от7,6·10-7M до 1,1·10-6M. Мутантный комплекс RAB(1–379):С R333K характеризуется значениемконстанты активации от 1,4·10-6M до 1,8·10-6M.
А для комплексов RAB(1–379):С R209K иRA(91–244):С M234A в литературных источниках можно найти только по одному измерению –соответствующие константы активации равны 1,7·10-6M и 2,8·10-8M.Важный параметр, позволяющий использовать значения констант активации втеоретических построениях, – константа Михаэлиса. В таблице 1.1 приведено значениеконстанты Михаэлиса для кемптида – наиболее часто используемого в экспериментах субстратаПКА Iα. Исходя из экспериментальных данных, оно составляет 1,6·10-5M.1.7.
Связь настоящего исследования с литературными даннымиОбобщая все вышеизложенные данные, можно сказать, что RIα – самостоятельныйбелок, самой изученной функцией которого является регуляция каталитической активностипротеинкиназы А. Однако на этом его роль в клетке не ограничивается. И очень возможно, чтовесь спектр белков, в работе которых тем или иным образом участвует RIα, пока не определен.Все домены RIα важны для ее функционирования. Но только два из них (цАМФ-связывающиедомены А и В) способны существовать в виде двух дискретных конформаций (H и В), имеющихразное сродство к ряду белков и низкомолекулярных соединений. Переходу А- и В-доменовмежду конформациями отводится ключевая роль в осуществлении RIα регуляции активностивзаимодействующих с ней белков.
цАМФ и ряд других циклических нуклеотидов ускоряютH→B переход цАМФ-связывающих доменов. В то же время факторов, ускоряющих обратный(B→H) переход пока не обнаружено. Помимо RIα, цАМФ-связывающие домены входят в составдругих изоформ ПКА и ПКГ, транскрипционных факторов прокариот, HCN и CNG каналов,белка EPAC и, возможно, других белков. Функционирование всех этих белков такжеопределяется переходами цАМФсвязывающих доменов между H- и В-конформациями.35В свете перечисленных фактов становится очевидна необходимость пониманиямеханизма конформационных изменений цАМФ-связывающих доменов.
Для разрешения этоговопроса сделано уже многое, но, тем не менее, не все. Так, предложено, что в передачеинформации о связывании лиганда на удаленные от него структуры белка участвуют два«переключателя». В модели электростатического «переключателя» R209–D170–R226 придаетсязначение электростатическим взаимодействиям между отрицательно заряженным лигандом ицАМФ-связывающим сайтом, имеющим на своей поверхности области положительногопотенциала.
Одному из остатков (R209), участвующему в создании положительного потенциаласайта и взаимодействующему напрямую с лигандом, отводится при этом ключевая роль взапуске конформационных изменений всего домена. К существенным недостаткам моделиэлектростатического«переключателя»можноотнестиеенесоответствиенекоторымэкспериментальным данным и отсутствие прямого доказательства, ее подтверждающего.Модель гидрофобного«переключателя» L203–Y229, напротив, описывает доказаннуюэкспериментально связь между конформационными изменениями ФСК и B-спирали.
Однакомеханизм, посредством которого связывание лиганда приводит к изменениям ФСК, остается врамках этой модели вне рассмотрения.Наше исследование направлено на устранение выявленных пробелов в пониманиифункционированияцАМФ-связывающихдоменов.Сиспользованиеммолекулярно-динамического моделирования мы оценили значение электростатического и гидрофобного«переключателей» в поддержании стабильности H- и B-конформаций и в обеспечении переходамежду ними. Также, мы предложили свою модель электростатического «переключателя»,передающего информацию о связывании лиганда на гидрофобный «переключатель». И взавершение, мы охарактеризовали наиболее вероятную последовательность событий, лежащуюв основе H→B конформационного перехода А-домена RIα.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
