Диссертация (1145986), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Мера достижения B-конформации в каждом случаеоценивалась по положению конформационно подвижных фрагментов белка (ФСК, N3A-мотива,B/C-спирали) относительно их положения в B-конформации. Численно такая оценкапроводилась с помощью RMSD-функций, как описано в разделе 2.5.1.В общем случае разработанная нами методика моделирования H→B конформационногоперехода включала в себя пять последовательных этапов.На первом этапе комплекс, представляющий собой А-домен в H-конформации с цАМФ,находящимся в связывающем сайте, нагревался в течение 100 пс до температуры близкой к350 K, а затем моделировался в NVE ансамбле до перехода ФСК в В-конформацию.
Еслиожидаемых изменений ФСК не происходило за 10 нс, то такая система не использовалась длядальнейших расчетов. Этот отбор был вызван необходимостью сокращения массива данных дляпоследующего анализа и экономией дискового пространства.Остальные этапы моделирования проводились в NVT ансамбле при температуре 300 K,поддерживаемой постоянной с использованием динамики Ланжевена (коэффициент трения γсоставлял 5 пс-1).44На втором этапе методом классической МД моделировались события, описанныеХольгером Рехманном в рамках модели гидрофобного «переключателя» (раздел 1.3.2).
Кактолько все изменения конформации, относящиеся к работе гидрофобного «переключателя»,можно было считать совершившимися, начинался третий этап моделирования, отличающийсяот второго применением ускоренной МД (подробнее – раздел 2.4.2.2). Цель этого этапа состоялав получении π-спирального фрагмента в составе B/C-спирали, на месте которого, всоответствии с нашим предположением, должен был возникнуть излом между B- и Сспиралями (излом показан на рисунке 1.2 Б). Важно отметить, что необходимость третьего этапаопределяется состоянием системы – и в ряде опытов он был опущен, так как переход фрагментаB/C-спирали в π-форму происходил в рамках классической МД на втором этапе моделирования.Четвертый этап моделирования проводился методом классической МД и длился до тех пор,пока на границе B- и С-спиралей не начинал формироваться излом.
Завершение этого процессаврамкахчетвертогоэтапачастостановилосьоченьдолгимиз-заобразованияэлектростатического взаимодействия между аминокислотными остатками K240 (C-спираль) иD140 (N3A-мотив). Факт антагонизма между названным взаимодействием и формированиемизлома B/C-спирали хорошо известен в литературе [36]. Поэтому перед пятым этапоммоделирования мы производили мутационную замену K240A (а вместе с ней и R239A),позволяющую А-домену беспрепятственно и быстро завершить переход в В-конформацию.Моделирование на этом этапе также проводилось методом классической МД и длилось послевизуального определения B-конформации еще 10 – 15 нс.
Последнее было необходимо дляподтверждения стабильности полученных нами структур и оценки их соответствия Bконформации.В рамках предложенной методики среднее время перехода А-домена из H- в Вконформацию составляет приблизительно 30 нс (17 – 52 нс для доменов белка дикого типа и 16нс для домена с мутационной заменой R209K), а общее время моделирования, болеепродолжительное из-за длительного уравновешивания системы на последнем этапе, –40 – 45 нс. Оба показателя относительно малы по сравнению с временами, характеризующимиобычноконформационныепереходыбелка,чтоделаетописаннуюметодикулегковоспроизводимой при любом уровне вычислительных возможностей.2.4.2.2. Метод ускоренной молекулярной динамики (уМД)Метод ускоренной молекулярной динамики (accelerated molecular dynamics, aMD, уМД)[99, 100] встроен в пакет программ NAMD.
В его основу положено увеличение скоростиконформационных изменений молекул при уменьшении глубины энергетических минимумов.На практике этот метод реализован следующим образом. К потенциальной функции системы45V(r) (или к ее компоненте) добавляется повышающее слагаемое (boost potential) ∆V(r), котороеr( E − V (r )) 2равно нулю, если V (r ) ≥ E , и описывается выражением, если V (r ) < E . Здесь αα + E − V (r )(положительное вещественное число) и E (вещественное число) – параметры, значения которыхвыбираются исходя из характеристик исследуемой молекулы. E представляет собой порог, ккоторому стремится потенциальная энергия системы V*(r)=V(r)+∆V(r), если V (r ) < E ; а α – такназываемый фактор ускорения, определяющий насколько близка потенциальная функция V*(r) куровню E и насколько плоской является ее поверхность.
Легко показать, что наибольшееускорение конформационных переходов достигается при больших значениях Е и маленькихзначениях α, однако моделирование при таких условиях часто оказывает дестабилизирующеевоздействие на систему.Схема, иллюстрирующая изменение функции потенциальной энергии при переходе отклассической МД к уМД, представлена на рисунке 2.1.Когда потенциальная энергия системы V(r) (показана жирной линией) становится ниже порогового уровня E, к нейдобавляется повышающее слагаемое.
Измененный профиль потенциальной энергии (тонкими линиями показанонесколько вариантов этого профиля в зависимости от значения параметра α) характеризуется меньшими барьерами,разделяющими энергетические минимумы, чем исходный профиль. Рисунок взят из [101]Рисунок 2.1 – Изменение функции потенциальной энергиипри переходе от классической МД к уМДВ рамках настоящей работы повышающее слагаемое ∆V(r) добавлялось только кдиэдральному компоненту потенциальной функции (Vдиэдр), чтобы способствовать быстромуизменению диэдральных углов, но при этом не препятствовать образованию гидрофобныхвзаимодействий. В соответствии с нашими предположениями, подтвержденными впоследствиирезультатами работы (раздел 6.3.3), такой подход наилучшим образом отвечал задаче46моделирования перехода фрагмента B/C-спирали в π-форму.Выбор значений параметров E и α, как уже было отмечено выше, зависит от свойствконкретной системы, но в качестве начального приближения можно использовать следующиеэмпирические правила [102]:E = Vдиэдр + 4 N ,α = 4 5 N , гдеN – количество аминокислотных остатков белка.В исследуемом нами А-домене RIα (а.
о. 118 – 242) содержится 125 аминокислотныхостатков. Значение Vдиэдр, определенное в ходе второго этапа моделирования (раздел 2.4.2.1) всреднем равняется 500 ккал/моль. Таким образом, в соответствии с названными эмпирическимиправилами значения параметров E и α в первом приближении составляют 1000 и 100 ккал/мольсоответственно.Тем не менее в процессе экспериментального подбора условий уМД мы отступили отэтого начального приближения, уменьшив пороговое значение E (800 – 1000 ккал/моль взависимости от конкретного опыта)11, но приблизив V*диэдр к этому порогу, благодаряуменьшению значения α (2 ккал/моль). Как показывают предпринятые нами оценки(таблица 2.1) такое отступление не приводит к существенному увеличению повышающегослагаемого ∆V(r), а напротив, в некоторых случаях способствует его уменьшению (при E = 800ккал/моль), что в целом благоприятно сказывается на стабильности системы в ходе уМДмоделирования.
Кроме того, допустимость выбранных нами значений E и α косвенноподтверждается полученными результатами: переходом фрагмента B/C-спирали в π-форму исохранением нативной конформации остальных структур А-домена (в том числе наименеестабильных N- и С-концевых его участков).11В трех опытах E равнялось 850 ккал/моль, по два опыта было проведено со значениями E 800, 900 и1000 ккал/моль, в четырех оставшихся опытах переход фрагмента B/C-спирали ФСК в π-форму происходил безприменения метода уМД47Таблица 2.1 – Зависимость диэдрального компонента потенциальной энергии при уМД (V*диэдр= Vдиэдр+∆V) от выбора значений параметров E и α12E = 1000 ккал/мольE = 1000 ккал/мольE = 900 ккал/мольE = 800 ккал/мольα = 100 ккал/мольα = 2 ккал/мольα = 2 ккал/мольα = 2 ккал/мольVдиэдр∆VV*диэдр∆VV*диэдр∆VV*диэдр∆VV*диэдр500417917498998398898298798600320920398998298898198798700225925298998198898987988001339331989989889808009005095098998090009001000010000100001000010002.4.3.
Математическая обработка результатов методами факторного икросскорреляционного анализовДля описания перехода А-домена RIα из H- в В-конформацию было отобрано двадцатьшесть коллективных переменных (параметров), краткая характеристика которых дана втаблице 2.2. Среди перечисленных переменных есть расстояния между атомами, энергиивзаимодействия между группами аминокислотных остатков и RMSD, характеризующиеблизость конформационно подвижных фрагментов белка (ФСК, N3A-мотива и B/C-спирали) кB-конформации. Подробно смысл каждого из параметров поясняется при изложениирезультатов в главе 6.Для каждой из полученных траекторий мы строили зависимость значений всехпараметров от времени и, определив промежутки, на которых все кривые выходили на плато,разделяли по ним траектории на этапы.
Важно отметить, что эти этапы не совпадали для разныхтраекторий, а сам процесс разделения носил чисто технический характер и был необходим длякорректного определения коррелирующих параметров в процессе факторного анализа.Переходя в представлении траекторий от фазового пространства к пространствувыбранных коллективных переменных, мы преследовали цель уменьшить размерность данных с3N×T (где N = 1990 – число атомов белка и лиганда, а T – число точек траектории), до 26×T,сохранив при этом информацию о H→B конформационном переходе А-домена.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
