Диссертация (1145986), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Только при переходе от комплекса RIα(91–244):С к комплексу RIα(91–379):С значение константы диссоциации практически не изменяется [42, 35].На основании приведенных данных был сделан вывод [32] о ключевой роливзаимодействий, заключенных в первых трех сайтах связывания, в стабилизации RC комплекса,24и особом значении B-домена для обеспечения эффективной активации ПКА Iα приотносительно невысоких концентрациях цАМФ. Было предположено [32], что цАМФиндуцированное изменение конформации В-домена необходимо для смещения С-спирали Адомена с поверхности С-субъединицы и облегчения, таким образом, цАМФ-зависимойдиссоциации RC комплекса.
Часто при описании этого процесса B-домен называют«привратником» [32].Такоеназваниеобусловленогипотезой,согласнокоторойдоконформационного перехода B-домена и смещения С-спирали связь цАМФ с А-доменомневозможна. Как мы уже отмечали, такая гипотеза встречает много противоречий со стороныэкспериментальных данных.
Тем не менее с чем бы ни сравнивали В-домен, его роль вуменьшении значения константы активации ПКА Iα можно считать доказанной.Еще одним важным результатом является относительно высокое сродство RIαсубъединицы, находящейся в В-конформации, к С-субъединице [43]. Оно обусловлено тем, чторазрыв взаимодействия между каталитическим сайтом С-субъединицы и ингибиторнымпептидомR-субъединицынеявляетсяцАМФ-зависимымпроцессом.RCкомплекс,стабилизированный этим взаимодействием, диссоциирует самопроизвольно, и в присутствиивысокой концентрации субстрата равновесие реакции диссоциации смещается практическиполностью в сторону свободных R- и С- субъединиц [42].Итогом всех предпринятых исследований стало описание механизма диссоциации RCкомплекса или, что то же самое, механизма активации ПКА Iα [4].
Согласно этому механизмусначала происходит цАМФ-зависимый переход В-домена в В-конформацию, результатомкоторого является смещение С-спирали А-домена с поверхности С-субъединицы. Затем Вконформацию принимает А-домен6. И в завершении RC комплекс в присутствии субстратадиссоциирует на отдельные R- и С-субъединицы.Главнымдетализация.АнедостаткомполучитьпредложенногодетальноемеханизмаописаниеявляетсяактивацииПКАегоIαнедостаточнаябеззнанийоконформационных переходах отдельных цАМФ-связывающих доменов представляется вряд ливозможным.1.5. Заселенность конформаций отдельных цАМФ-связывающих доменов и RсубъединицыДля цАМФ-связывающих доменов характерно состояние динамического равновесиямежду H- и В-конформациями [30, 31].
На положение этого равновесия влияют различные6В соответствии с предложенной гипотезой о недоступности А-сайта лиганду цАМФ связывается с А-доменомпосле конформационных изменений В-домена. Но в какой конкретно момент это происходит, в работах неупоминается.25факторы, как-то: окружающие белки, низкомолекулярные лиганды или же фрагменты белковойцепи, предшествующие или следующие за цАМФ-связывающим доменом.С использованием метода ЯМР установлено, что H- и B-конформации А-домена ПКА Iα(91-244) стабильны в равной мере (GB~GH) [31], хотя по данным рентгеноструктурного анализаА-домену в отсутствие лигандов свойственна только B-конформация [5].
Это разногласие,видимо, обусловлено тем, что А-домены, представленные В-конформацией, могут быть болеевыгодно упакованы в кристалле. Присутствие любого из агонистов, например, цАМФ или SpцАМФS смещает существующее равновесие в сторону B-конформации. Частичные агонисты Адомена, такие как O2′-метил-цАМФ тоже увеличивают заселенность B-конформации, но вменьшей степени, чем полные агонисты [31]. Высокая доля H-конформации достигается у Адомена в присутствии С-субъединицы или обратного агониста Rp-цАМФS.
Тем не менеепоследний эффективно стабилизирует H-конформацию, только если связывается с RCкомплексом [5]. В случае взаимодействия Rp-цАМФS со свободным А-доменом, увеличениезаселенности H-конформации оказывается меньшим чем то, которое наблюдается присвязывании свободного А-домена с С-субъединицей [31]. Также равновесие А-доменасмещается в сторону H-конформации при удалении линкерного фрагмента (а. о. 91 – 118),причем в этом случае устойчивость B-конформации снижается, даже если в цАМФсвязывающем сайте находится цАМФ [31].Равновесие между конформациями свойственно и цАМФ-связывающему домену белкаEPAC1 [30].
У этого домена заселенность Н-конформации несколько выше, чем B, и составляетменее 80%.Исследований конформационного равновесия изолированного B-домена RIα непроводилось. Тем не менее как уже отмечалось в предыдущем разделе, этот домен в составе RCкомплекса не образует стабильных взаимодействий с С-субъединицей и поэтому значительнуючасть времени проводит в свободном состоянии. Какая конформация предпочтительней длянего, на настоящий момент неизвестно. Но рассуждения, приведенные в разделах 3.5.4 и 4.3.2настоящей диссертации, дают основание полагать, что в этом случае равновесие сдвинуто всторону B-конформации. Это предположение, однако, не относится к RII изоформам ПКА. Уэтих изоформ контакты B-домена с С-субъединицей стабильны, и B-домен в составе RCкомплекса находится в H-конформации [71].Для RIα субъединицы, состоящей из двух цАМФ-связывающих доменов, тожехарактерно равновесие между несколькими конформациями.
При этом, говоря о конформацииR-субъединицы, часто подразумевают конформацию А-домена в составе R-субъединицы. Таккак именно состояние А-домена обуславливает форму и размеры белка, которые можноопределить экспериментально [31].26В соответствии с данными, полученными методом ЯМР анализа [42], H- и Вконформации А-домена в составе RIα(91–379), как и в случае отдельного А-домена,характеризуются одинаковой стабильностью. В присутствии агонистов у обоих доменовзаселена преимущественно В-конформация. А в случае взаимодействия обратного агониста RpцАМФS со свободной RIα, равновесие, по крайней мере А-домена, смещается в сторону Hконформации [5, 7]. Последние данные получены путем исследования изменения свободнойэнергии при индуцированном мочевиной анфолдинге и спектрометрии ионной подвижности /масс спектрометрии RIα(91–379).
В то же время существует кристаллическая структуракомплекса RIα с Rp-цАМФS, представленная В-конформацией RIα [27]. Важная информациядля объяснения возникшего разногласия, на наш взгляд, заключается в методике приготовленияэтой структуры, о чем пойдет речь в разделе 4.3.2 настоящей диссертации.1.6. Константы, характеризующие активацию ПКА Iαα1.6.1. Значения констант, характеризующих активацию ПКА IαКонстанты скоростей реакций, равновесные константы, а также константы активации –важные показатели, на которые должна опираться и которые должна объяснять любая модельактивациипротеинкиназыА,какфеноменологическая,такиполученнаяметодоммолекулярного моделирования.
Тем не менее авторы, видимо, недооценивают значимостьопределенных ими констант для понимания функционирования ПКА. Иначе каким образомможно объяснить отсутствие в большинстве работ данных о температуре, при которойпроводились измерения. Более того, в случае с константами активации ПКА далеко не в любойработе указаны концентрации субстрата и даже фермента, без которых само понятие константыактивации теряет смысл.Тем не менее в этой главе обзора литературы мы предприняли попытку собрать всеимеющиеся данные о значениях констант, характеризующих активацию ПКА Iα (таблицы 1.1,1.2). Также в разделе 1.6.2 мы попытались по возможности обобщить эти данные и привести ихк единому виду.Так как сравнение значений констант, измеренных при разных температурах,невозможно, возникает необходимость в приведении всех значений к одной температуре.
Вкачестве такой температуры удобно выбрать 300 K (численное приближение для понятия«комнатная температура»), при которой было получено большинство констант активации иконстанта Михаэлиса. Если авторы работ не приводили никаких данных, кроме измереннойконстанты и температуры T, при которой проводились измерения, мы в первом грубомприближении считали, что K DT =300 ≈ K DT . Нестрогость этого приближения в какой-то мереоправдывается тем, что в настоящей работе предпринята первая попытка анализа всей27совокупности значений констант, а также тем, что без сделанных приближений было быневозможно построение численной модели активации ПКА Iα, приведенной в разделе 3.5.4настоящей диссертации.Таблица 1.1 – Константы равновесия и скоростей реакций, характеризующие процессы,протекающие при активации протеинкиназы А Iα7БелокT, K Kd, МKass,Kdiss,c-1T = 300 KлигандМ-1c-1Kd, МKass, М-1c-1Константа диссоциации цАМФ из комплекса RCcAMP.
А-домен.RAB2982,2·10-6––2,2·10-6–G323ERAB(1–379)–>1,5·10-6 ––>1,5·10-6 –R333KRA (1-259)295* 1,1·10-61,1·10-6Константа диссоциации цАМФ из комплекса RCcAMP. B-доменRAB––4,0·10-7–2984,0·10-7G199ERAB(1–379)–8,07·10-7 ––8,07·10-7 –R209KКонстанта диссоциации цАМФ из комплекса RCcAMP. Оба доменаRAB2982,9·10-6––2,9·10-6–-7RAB(1–379)–1,66·10––––*-7-7RAB(1–379)2952,00·10––2,00·10–RAB277* 5,0·10-8––5,0·10-8–Константа диссоциации лиганда из комплекса RcAMP.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
