Диссертация (1145986), страница 8
Текст из файла (страница 8)
А-доменRAB2982,9·10-9––2,9·10-9–G323EцАМФRAB(1–379)–1,49·10-7 ––1,49·10-7 –R333KRA(1–259)295* 1,1·10-7––1,1·10-7–RA(93–259)295* 1,1·10-7––1,1·10-7–-8-8RАВ(1–379)–3,5·10––3,5·10–цАМФRАВ(1–379)303* 6,0·10-86,0·10-8цАМФRАВ(92–379) 303* 5,0·10-85,0·10-8цАМФ7Kdiss, c-1Ссылка–[72]–[69][68]–[72]–[69]––––[72][69][68][49]–[72]–[69]–––[68][68][69][79][79]Пояснения к таблице 1.1: * – в тексте статьи названа температура, при которой проводились измерения. Вслучаях, когда температура в статье не была приведена, но о ней можно было догадаться по аналогичным работамэтих же групп авторов, температура также приведена в таблице, но без соответствующего символа.
† – в текстестатьи приведены данные об изменениях энтальпии и энтропии в ходе реакции, что дает возможность точнорассчитать значения констант при температуре 300K. ‡ – комнатная температура, которая, в соответствии сраспространенным приближением, здесь и далее принята за 300 K. Все константы приведены без ошибок, дажеесли таковые указаны у авторов. Курсивом выделены строчки, в которых приведены значения, на наш взгляд,выпадающие из основной массы данных или не согласующиеся с нашей моделью, приведенной в разделе 3.5.4 ипотому не учитывающиеся при получении средних значений констант.28Продолжение таблицы 1.1RA(92–260)293*† 3,8·10-8––5,66·10-8цАМФRA(92–260)293*† 3,8·10-81,15·106 4,15·10-2 5,5·10-86-AHцАМФ293*† 1,10·10-7 7,04·105 8,18·10-2 2,05·10-7RA(92–260)8-AHAцАМФRA(91–244)295*–3,1·106––FM-R239CКонстанта диссоциации цАМФ из комплекса RcAMP.
B-домен.RAB2980,9·10-9––0,9·10-9G199ERАВ(1–379)–1,5·10-8––1,5·10-8-7RAB(1–379)–1,30·10––1,30·10-7R209KRАВ(1–379)303*1,5·10-81,5·10-8цАМФRАВ(92–379) 303*5,0·10-85,0·10-8цАМФКонстанта диссоциации цАМФ из комплекса RcAMP. Оба домена.RAB2981,3·10-9––1,3·10-9RAB(1–379)295*1,7·10-8––1,7·10-8*-8RAB2931,7·10––1,7·10-8RAB277*1,5·10-8––1,5·10-8-8RAB(1–379)–2,2·10––2,2·10-8Константа диссоциации комплекса RAC.RA (1–260)2962,6·10-96,9·1051,8·10-32,6·10-9WTRA(91–244)295*0,19·10-9 2,0·1073,8·10-30,19·10-9FM-R92CRA(91–244)295*0,15·10-9 2,4·1073,7·10-30,15·10-9FM-R92CRA(91–244)295*0,28·10-9 2,5·1076,9·10-30,28·10-9FM-R239CRA(91–244)–0,19·10-9 7,2·1071,3·10-20,19·10-9WTRA(91–244)2960,18·10-9 1,5·1072,7·10-30,18·10-9WTRA(91–244)2960,54·10-9 1,7·1079,1·10-30,54·10-9R226ARA(91–244)2960,70·10-9 8,7·1066,1·10-30,70·10-9L233ARA(91–244)2961,09·10-9 7,5·1068,2·10-31,09·10-9M234A––[73]1,6·1069,0·10-2[73]1,06·1062,17·10-1[73]3,1·106–[42]––[72]––––[69][69][79][79]––––––––––[72][68][74][49][69]6,9·1051,8·10-3[69]2,0·1073,8·10-3[65]2,4·1073,7·10-3[42]2,5·1076,9·10-3[42]7,2·1071,3·10-2[75]1,5·1072,7·10-3[32]1,7·1079,1·10-3[32]8,7·1066,1·10-3[32]7,5·1068,2·10-3[32]29Окончание таблицы 1.1Константа диссоциации комплекса RABCRAB(1–379)2960,19·10-9 0,12·106 2,3·10-50,19·10-90,12·106WTRAB(1–379)296*0,1·10-90,81·106 8,0·10-50,1·10-90,81·106WTRAB(91–379) 2960,41·10-9 0,8·1063,0·10-40,41·10-90,8·106WTRAB(91–379) 2960,72·10-9 1,8·1061,3·10-30,72·10-91,8·106R226ARAB(91–379) 2961,28·10-9 0,8·1061,0·10-31,28·10-90,8·106L233ARAB(91–379) 2961,08·10-9 1,2·1061,3·10-31,08·10-91,2·106M234ARAB(1–379)2960,15·10-9 1,9·1062,9·10-40,15·10-91,9·106R333KRAB(92–379) 2960,89·10-10 1,9·1061,7·10-40,89·10-10 1,9·106R333KRAB R333K296*0,2·10-101,12·106 2,2·10-50,2·10-101,12·106RAB(1–379)2960,36·10-10 1,4·1065,1·10-50,36·10-10 1,4·106R209KКонстанта диссоциации комплекса RA 91-244 C.
А-домен занят цАМФRA FM295*3,2·10-81,7·1070,553,2·10-81,7·107R92CRA FM295*1,3·10-72,0·1072,61,3·10-72,0·107R92CКонстанта диссоциации комплекса RA 91-244 C. А-домен занят Sp-цАМФRA FM295*4,0·10-81,9·1070,754,0·10-81,9·107R92CКонстанта диссоциации комплекса RA 91-244 C. А-домен занят Rp-цАМФRA FM295*4,0·10-111,9·1077,5·10-44,0·10-111,9·107R92CКонстанта диссоциации комплекса RABC. A-домен занят цАМФRAB WT298–∼1,0·10-9 –∼1,0·10-9 –Константа диссоциации комплекса RABC. B-домен занят цАМФRAB WT298–∼1,0·10-9 –∼1,0·10-9 –-8RAB WT2961,1·10––1,1·10-8–Константа диссоциации комплекса RABC. Оба домена заняты цАМФRAB WT2982,5·10-7––2,5·10-7–RAB WT298*2,4·10-7––2,4·10-7–*-7-7RAB WT2981,6·10––1,6·10–RAB WT298*2,5·10-7––2,5·10-7–Константа Михаэлиса для кемптидаС WTк.т.*‡1,6·10-5––∼1,6·10-5 –2,3·10-5[69]8,0·10-5[35]3,0·10-4[32]1,3·10-3[32]1,0·10-3[32]1,3·10-3[32]2,9·10-4[69]1,7·10-4[69]2,2·10-55,1·10-5[76][69]0,55[65]2,6[42]0,75[65]7,5·10-4[65]–[72]––[72][69]––––[72][43][43][43]–[67]30Таблица 1.2 – Константы активации протеинкиназы А IαБелокT,KKакт,МКонстанта активации комплекса RABC.RAB(1–379) WTк.т.1,01·10-7RAB(1–379) WT295 2,00·10-7RAB(1–379) WTк.т.1,44·10-7RAB(1–379) WTк.т.0,88·10-7RAB WTк.т.1,63·10-7RAB(91–379) WT–0,80·10-7RAB(91–379) R226A–0,84·10-7RAB(91–379) L233A–0,26·10-7RAB(91–379) M234A–0,38·10-7RAB(1–379) R333Kк.т1,4·10-6RAB(1–379) R209Kк.т1,7·10-6RAB(92–379) R333Kк.т1,8·10-6RAB(1–379) R209K R333K к.т2,2·10-6Константа активации комплекса RAC.RA(94–235)к.т.2,25·10-7RA(1–259)295 1,1·10-6RA(93–259)295 1,1·10-6RA(91–244) WT–0,9·10-6RA(91–244) WT277 7,63·10-7RA(91–244) WT–1,0·10-6RA(91–244) R226A–5,4·10-8RA(91–244) L233A–2,0·10-8RA(91–244) M234A–2,8·10-8RA(91–244) R241A–9,1·10-6RA(91–244) L203A–0,8·10-6RA(91–244) I204A–2,4·10-6RA(91–244) Y229A–0,66·10-6КонцентрацияRC комплекса,МКонцентрация Ссылкакемптида,М2,0·10-82,0·10-8–3,0·10-83,0·10-82,5·10-82,5·10-82,5·10-82,5·10-82,0·10-82,0·10-82,0·10-82,0·10-81,0·10-4–––1,0·10-41,0·10-41,0·10-41,0·10-41,0·10-41,0·10-41,0·10-41,0·10-4[69][68][67][35][76][32][32][32][32][69][69][69][69]–2,0·10-82,0·10-83,0·10-8–2,5·10-82,5·10-82,5·10-82,5·10-83,0·10-83,0·10-83,0·10-83,0·10-8–––1,0·10-4–1,0·10-41,0·10-41,0·10-41,0·10-41,0·10-41,0·10-41,0·10-41,0·10-4[67][68][68][44][67][32][32][32][32][44][44][44][44]1.6.2.
Обсуждение приведенных значений констант, характеризующих активацию ПКА Iα1.6.2.1. Константы диссоциации RC комплекса на свободные R- и С-субъединицыСогласно существующим данным [77, 78], диссоциация R- и С-субъединиц вприсутствии цАМФ происходит в две стадии.
На первой из них, вследствие перехода Rсубъединицы в B-конформацию, формируется комплекс, в котором R- и С-субъединицы связаныпредположительно только взаимодействием между псевдосубстратной последовательностью икаталитическим сайтом. На второй стадии этот комплекс диссоциирует, высвобождая активныеC-субъединицы. Для диссоциации R- и С-субъединиц в отсутствие цАМФ двухстадийногопроцесса не показано.Исходя из такой последовательности событий, константы диссоциации RABC и RACкомплексов в отсутствие цАМФ и в случае, если один или оба цАМФ-связывающих сайтазанятылигандом,должнысущественноразличаться.Приведенныевтаблице1.131экспериментальные данные подтверждают это предположение.Среднее значение константы диссоциации RAC комплекса в отсутствие цАМФсоставляет 0,2·10-9 М (усреднение по данным из таблицы 1.1), если не принимать в расчет напорядок большее значение 2,6·10-9М, полученное в работе [69].
Мутации остатков B-спирали Адомена R226A, L233A и M234A уменьшают стабильность RAC комплекса [32], что даетоснование говорить о роли этих остатков в обеспечении взаимодействия B/C-спирали А-доменас С-субъединицей. Названные мутации делают RAC комплекс похожим на RABC комплекс сцАМФ-связанным B-доменом. Авторы статьи отмечают, что схожесть заключается не только вблизости значений констант, но и в структурных чертах обоих белков. B-домен сам по себеслабо связан с С-субъединицей и может находиться как В-, так и H-конформации. СвязываниецАМФ в сайте B-домена, очевидно, смещает равновесие в сторону B-конформации, и, какрезультат, уменьшает взаимодействие между B/C-спиралью А-домена с С-субъединицей.
Этотже эффект достигается внедрением мутаций R226A, L233A и M234A.Среднее значение константы диссоциации RABC комплекса в отсутствие цАМФсоставляет 0,15·10-9М (таблица 1.1), если не учитывать значение, приведенное в работе [32](0,41·10-9M). Таким образом, количественные данные подтверждают гипотезу, согласно которойпоявление B-домена в эволюции приводит лишь к незначительному увеличению стабильностиRC комплекса, но при этом дает возможность более гибкой регуляции активации ПКА.
Всоответствии с литературными данными, мутации R226A, L233A и M234A ослабляют комплексRABC [32], а мутации R333K и R209K – наоборот делают его более прочными [69, 76].Последний факт представляет особый интерес, так как ни R209, ни R333 не участвуют вовзаимодействии R- и С-субъединиц. Для RABC R209K комплекса константу диссоциации можнопринять приближенно равной 0,4·10-10M, а для RABC R333K комплекса среднее значениеконстанты диссоциации равно 0,6·10-10M.В присутствии цАМФ значение константы диссоциации RAC комплекса возрастает(таблица 1.1), что хорошо согласуется с вышеизложенной моделью цАМФ-зависимой активацииПКА. Из-за большого разброса значений соответствующей константы диссоциации мы в первомприближении усреднили значения из таблицы 1.1, относящиеся как к RACcAMP, так и к RACSpcAMPS комплексам.
В результате среднее значение константы диссоциации RACcAMP и RACSpcAMPSкомплексовоказалосьприближенноравным6,7·10-8M.Темнеменеекакпродемонстрировано нами в приложении А, такая оценка может использоваться только вкачестве очень грубого приближения.Как следует из экспериментальных данных, приведенных в таблице 1.1, константадиссоциации RAC комплекса в присутствии Rp-цАМФS равняется 4,0·10-11M, что не толькоменьше константы диссоциации данного комплекса в присутствии агонистов (цАМФ и Sp-32цАМФS), но также меньше константы спонтанной диссоциации RAC комплекса (0,2·10-9 М).Таким образом, принятое в литературе обозначение Rp-цАМФS как обратного агониста (а неантагониста) ПКА Iα, является корректным.Константа диссоциации RABC комплекса, оба домена которого заняты цАМФ,существенно выше константы спонтанной диссоциации (0,15·10-9М).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
