Диссертация (1145986), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Модель электростатического «переключателя», напротив, объясняет, каким образоминформация о связывании цАМФ передается за пределы цАМФ-связывающего сайта, однакологике этой модели противоречит факт активации ПКА с мутационными заменами R209 и D170[34, 35].Методы молекулярного моделирования являются перспективным подходом исследованияконформационных переходов белков. Тем не менее эти методы ни разу не были применены дляподтверждения моделей электростатического и гидрофобного «переключателей». А единственная попытка показать конформационный переход цАМФ-связывающего домена не принеслажелаемого результата, так как белок все время моделирования оставался вблизи исходного8энергетического минимума [36].Цель работы.
Для объяснения механизма активации ПКА прежде всего надорасшифровать механизм перехода А-домена RIα из H- в В-конформацию, что и стало цельюработы. В рамках поставленной цели были выделены следующие задачи, решаемые методамимолекулярного моделирования:1)расшифровать механизм, посредством которого связывание цАМФ запускаетконформационный переход А-домена RIα;2)определить роль электростатического «переключателя» R209–D170–R226 вконформационном переходе А-домена RIα;3)установить роль гидрофобного «переключателя» L203–Y229 в конформационномпереходе А-домена RIα;4)описать наиболее вероятный путь перехода А-домена RIα из H- в В-конформацию.Методологическая основа исследования. При работе над диссертацией применяласьсовокупность методов молекулярного моделирования. Основные результаты были полученыметодами молекулярной динамики.
Вспомогательную роль играли квантово-химическиерасчеты и докинг.Научная новизна работы. В диссертации впервые расшифрованы все этапы механизмаперехода А-домена RIα из H- в B-конформацию и предложена модель электростатического«переключателя» цАМФ(O6)–A202(N-H)–G199(C=O), посредством которого цАМФ передаетинформацию о своем связывании на гидрофобный «переключатель» L203–Y229 и этимзапускает конформационный переход А-домена.
Подтверждена и дополнена существующаямодель гидрофобного «переключателя» L203–Y229. Впервые установлено, что движущей силойповорота B/C-спирали, происходящего при его переключении, является на первых этапахсохранение взаимодействия между Y229 и L203, а затем повышение энергии взаимодействияY229 с β-субдоменом в целом. Впервые показано, что для функционирования гидрофобного«переключателя» в А-домене RIα необходимо смещение N3A-мотива. Продемонстрировано, чтоинвариантность остатка аргинина в положении 209 не связана с его участием вэлектростатическом «переключателе» R209–D170–R226, а определяется рядом других функций.Основные положения, выносимые на защиту:1) цАМФ запускает переход А-домена регуляторной субъединицы ПКА Iα из H- в Вконформацию посредством электростатического «переключателя» цАМФ(O6)–A202(N-H)–G199(C=O), передающего информацию о связывании цАМФ на гидрофобный «переключатель»L203–Y229.2) В переходе А-домена регуляторной субъединицы ПКА Iα из H- в В-конформацию незадействован электростатический «переключатель» R209–D170–R226.
Однако аминокислотный9остаток в положении 209 выполняет ряд важных функций: (а) фиксация лиганда в связывающемсайте; (б) поддержание конформации β2β3-петли; (в) создание стерически благоприятныхусловий для размещения A202 в положении, характерном для B-конформации, и стабилизацияэтого положения путем образования взаимодействия с боковой цепью A202. Аргинин вположении 209 наилучшим образом совмещает выполнение всех перечисленных функций, чтоявляется причиной его инвариантности во всех цАМФ-связывающих доменах.3) Переход А-домена регуляторной субъединицы ПКА Iα из H- в В-конформациюпроисходит в три последовательных этапа.
На первом этапе в ответ на связывание лиганда Bконформацию принимает ФСК. На втором этапе происходит смещение N3A-мотива, поворотB/C-спирали и формирование в ее структуре витка π-спирали. На третьем заключительномэтапе на месте витка π-спирали образуется излом, который разделяет B/C-спираль на отдельныеB- и С-спирали.Достоверность результатов исследования обеспечивается:– учетом характеристик исследуемого белка и его конформационного перехода приподборе методов молекулярного моделирования;– статистической обработкой данных;– соответствием результатов работы данным литературы, полученным другими исследователями традиционными биохимическими методами.Научная и практическая значимость работы.
Результаты настоящего исследованияважны для фундаментальной биохимии, так как они объясняют механизм конформационногоперехода А-домена RIα как представителя большого семейства цАМФ-связывающих иродственных им доменов. Практическая значимость работы связана с тем, что белки,содержащие эти домены, выполняют важные функции в клетках, и изменение их активностичасто сопровождает собой патологические состояния или приводит к ним. В этой связиполученные данные могут быть использованы для направленного поиска новых эффективныхблокаторов и активаторов цАМФ-связывающих белков для дальнейшего использования вмедицине.Апробация результатов исследования.
Материалы диссертации были представлены наследующих конференциях: Политехнический симпозиум «Молодые Ученые – промышленностиСеверо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 2006); Двенадцатая Санкт-Петербургскаяассамблея молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2007); “The Second St.PetersburgInternational Conference on NanoBio Technologies NanoBio 08” (St.Petersburg, 2008); Научноенаследие академика Л.А. Орбели.
“Структурные и функциональные основы эволюции функций,физиологии экстремальных состояний”, Всероссийская конференция, посвященная 125-летиюсо дня рождения академика Л.А.Орбели (Санкт-Петербург, 2008); “Тринадцатая Санкт-10Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов” (Санкт-Петербург, 2008); 6-аяВсероссийская конференция “Молекулярное моделирование” (Москва,2009);Moscowconference on computational molecular biology MCCMB`09 (Moscow, 2009); “Современнаяхимическая физика” XXI симпозиум (Москва-Туапсе, 2009); “Third International NanoBioConference” (Zurich, 2010); XXI Съезд Физиологического общества имени И.
П. Павлова(Москва-Калуга, 2010); Пятнадцатая Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых испециалистов (Санкт-Петербург, 2010); 7-ая Всероссийская конференция «Молекулярноемоделирование»(Москва,2011);ПерваяМеждународнаяИнтернет-конференция«Математическое и компьютерное моделирование в биологии и химии. Перспективы развития»(Казань, 2012); Международная конференция «Биология – наука XXI века» (Москва, 2012); TheFirst International Conference «Quantitative imaging and spectroscopy in neuroscience» (St.Petersburg, 2012); FEBS Congress (St.
Petersburg, 2013); Moscow conference on computationalmolecular biology MCCMB`13 (Moscow, 2013).Публикации. Результаты диссертации опубликованы в 22 работах, в том числе в 5статьях, 4 из которых опубликованы в журналах по перечню ВАК РФ.Личный вклад автора. Соискатель принимала непосредственное участие в постановкезадач, разрабатывала пути их решения и проводила анализ литературных данных. Все расчеты иих обработка были выполнены соискателем лично. Соискателю принадлежит ведущая роль вобсуждении результатов, подготовке статей и докладов для конференций.Факторный и кросскорреляционный анализы, обработка результатов кластерного анализаи оценка полноты перехода А-домена в В-конформацию с помощью RMSD функций былипроведены под руководством и при участии Вершининой Е.
А., старшего научного сотрудникалаборатории информационныхтехнологий и математического моделирования ФГБУН«Институт Физиологии им. И. П. Павлова РАН».Расчеты с применением методов молекулярной динамики были выполнены на кластерахСПб Филиала МСЦ РАН (http://scc.ioffe.ru/) и Т-платформы СПбГУ, а также в вычислительномцентре Аубурнского университета США при любезном содействии профессора факультетахимии и биохимии М. Л.
МакКи и непосредственном участии сотрудника этого центра Т. Ли.Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав,заключения, выводов, списка литературы и трех приложений (А, Б и В). Работа изложена на141 странице печатного текста, содержит 7 таблиц и иллюстрирована 21 рисунком. В спискецитируемой литературы приведено 112 источников.111. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1 Протеинкиназа А.
Общие сведенияПротеинкиназа А (ПКА) была открыта в 1968 году Кребсом и сотрудниками, какфермент, фосфорилирующий белки по остаткам серина и треонина [38]. Спектр мишеней ПКАдостаточно широк. К ним относятся гистоны, факторы транскрипции (CREB, CREM, ATF1, NFκB, NF-AT и другие) [2], белки микротрубочек МАР-2 [39], Са2+-каналы L-типа, фосфоламбан[40], гликогенсинтаза [41] и многие другие белки. Этот список постоянно пополняется, и темсамым появляются все новые подтверждения участия ПКА, если не во всех, то в большинствеклеточных процессов.Собственно протеинкиназной активностью обладают белки, исторически получившиеназвание каталитических субъединиц ПКА (С-субъединиц). Они представлены тремяизоформами Сα, Сβ и Сγ [1, 3].Способность С-субъединиц фосфорилировать субстраты в отсутствие внешнего сигналасдерживается образованием неактивных комплексов между С-субъединицами и другимипептидами и белками [3].Наиболее изученным и, видимо, наиболее распространенным является ингибированиекаталитической активности С-субъединиц с помощью белков, исторически получившихназвание регуляторных субъединиц ПКА (R-субъединиц).
В таком случае неактивныекомплексы ПКА (RC комплексы) состоят из димера R-субъединиц, каждая из которых связана содной С-субъединицей. На настоящий момент известно четыре изоформы регуляторныхсубъединиц (RIα, RIβ, RIIα и RIIβ), в соответствии с чем RC комплексы также подразделяютсяна четыре типа: ПКА Iα, ПКА IIα, ПКА Iβ и ПКА IIβ. Изоформы регуляторных субъединицдовольно сильно отличаются друг от друга по строению и физико-химическим свойствам. Болеетого, они с разной эффективностью взаимодействуют с разными белками, в том числе и свыполняющими функцию заякоривания на мембранах (AKAP). Таким образом, именно отрегуляторных субъединиц зависит локализация, а следовательно, выбор мишеней ПКА [1 – 3].Несмотря на разные характеристики, все изоформы R-субъединиц обладают однимобщим свойством – изменением конформации в ответ на связывание внутриклеточногомессенджера циклического аденозин-3’,5’-монофосфата (цАМФ) [1 – 3].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
