Диссертация (1145986), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Построение профиля свободнойэнергии вдоль этой последовательности, которое планируется нами в дальнейшем, позволитперейти к объяснению взаимодействия RIα с С-субъединицей и другими белками.362. МЕТОДЫ2.1. Докинг лигандов в цАМФ-связывающие сайты А- и В-домена RIααДокинг цАМФ, Rp-цАМФS и Sp-цАМФS в цАМФ-связывающий сайт В-домена и цАМФв сайт А-домена проводился с помощью программы Quantum 3.3.0 в соответствии состандартной методикой, предложенной разработчиками программы [80]. Данная программаосуществляет докинг гибкого лиганда в жесткий белок, а затем минимизирует энергиюполучившегося комплекса.Пространственные структуры B-домена RIα (а.
о. 235 – 376) в B- и H-конформацияхбыли взяты из базы данных PDB под номерами 1NE6 (Sp-цАМФS -связанная RIα(109–376)) [27]и 2QCS (комплекс RIα(91–379):C) [4] соответственно. Как уже упоминалось в разделе 1.4, Bдомен в составе структуры 2QCS несет мутацию R333K, ослабляющую взаимодействие лигандас цАМФ-связывающим сайтом. Для того чтобы использовать B-домен из этой структуры внаших исследованиях, мы произвели обратную замену остатка K333. При этом был выбранконформер R333, характерный для гомологичного остатка R209 из А-домена.А-домен (а. о.
118 – 242) в B-конформации, как и B-домен, был взят из лигандсвязаннойструктуры 1NE6. H-конформация А-домена на момент проведения докинга (2008–2009 гг.) былапредставлена в двух структурах: 2QCS (RIα(91–379):C) [4] и 3FHI (RIα(91–244):C) [28]. Мывыбрали последнюю из них, как обладающую наименьшими размерами, а поэтому болееудобную в расчетах.Так как ФСК А-домена образует ряд контактов с С-субъединицей, докинг цАМФ в Адомен, находящийся в H-конформации, предполагает обязательный учет фрагментов Ссубъединицы, контактирующих с цАМФ-связывающим сайтом. Следуя этому требованию, мыне рассматривали А-домен в H-конформации отдельно от С-субъединицы, а использовали напервой стадии докинга RIα(91–244):C комплекс. На второй стадии докинга, представляющейсобой минимизацию энергии лигандсвязанного домена, мы оставили от С-субъединицы толькофрагмент (а.
о. 237 – 254), взаимодействующий непосредственно с цАМФ-связывающим сайтом. Это упрощение позволяет существенно сократить время расчета, но в то же время неотражается на значении численной характеристики взаимодействия лиганда с белком (∆Gº).2.2. Квантово-химический анализ параметров водородных связей, образуемыхэкваториальным атомом кислорода (серы) лиганда и амидной группой белкаОбъяснение механизма действия Rp-цАМФS как обратного агониста ПКА Iα являетсяключом к пониманию конформационных изменений ФСК. Важным шагом в его определениистала оценка длин и энергий водородных связей, образуемых экваториальным атомом37кислорода (серы) лиганда и амидной группой белка.Особенности водородной связи между цАМФ и амидной группой белка исследовались спомощью модельных соединений формилметиламина (модель амидной группы белка) итриметилфосфата (модель фосфатной группы цАМФ).
При анализе связи с участием RpцАМФS вместо триметилфосфата использовался триметилфосфотиоат.Минимизация энергии исследуемых связей выполнялась с использованием пакетаквантово-химических программ Gaussian`03 [81] методом Хартри–Фока–Рутаана [82] вбазисе 6-31+G(d) [83 – 86] без учета влияния среды, T = 0 K.2.3. Изучение конформационных переходов β-субдомена А-домена RIαα, равновесиямежду его конформациями и влияния на это равновесие мутационных замен R209Основные исследования, направленные на решение первых двух из поставленных задач(см. раздел Введение, стр.
8), были проведены на β-субдомене А-домена RIα. Удаление αсубдомена было важно не столько для установления механизма H→B перехода ФСК (этиданные впоследствии были подтверждены и на целом А-домене), сколько для изучениязаселенности конформаций β-субдомена, а также влияния на нее мутационных замен R209.Последнийвопросявляетсяключевымдляопределенияролиэлектростатического«переключателя» R209–D170–R226 и в частности остатка R209 в переходе между H- и Bконформациями. Однако его решение на модели целого А-домена требует больших затратвремени.
Использование отдельного β-субдомена позволяет существенно сократить времямоделирования, причем это сокращение носит двоякий характер. Во-первых, из-за уменьшенияколичества атомов в системе уменьшается время расчета одного шага МД, что непосредственноотражается на машинном времени. Во-вторых, в соответствии с нашими предварительнымирезультатами, удаление α-субдомена сокращает реальное (физическое) время конформационныхпереходов системы, что опять-таки приводит к уменьшению машинного времени.Тем не менее моделирование отдельного β-субдомена не является общепринятойметодикой исследования цАМФ-связывающих доменов. Поэтому ее использование должнобыть подкреплено демонстрацией стабильности β-субдомена и обоснованием корректностипереноса данных, полученных при его моделировании, на целый цАМФ-связывающий домен.То, что β-субдомен удовлетворяет этим требованиям, было установлено по результатаммоделирования.
Стабильность β-субдомена косвенно подтверждается отсутствием малейшихпризнаков его денатурации на временных отрезках, используемых в работе, (10 нс). В пользуприемлемости модели β-субдомена для изучения преобразований ФСК соответствующего емуцАМФ-связывающего домена также свидетельствуют и полученные нами данные. Подробноеих рассмотрение приведено в разделе 5.3.1.382.3.1. Подготовка β -субдоменаПространственные структуры β-субдомена А-домена RIα (A150 – D225) в В- и Hконформациях были взяты из базы данных PDB под номерами 1NE6 и 3PVB [27, 29]соответственно.
Последняя имеет преимущество перед двумя другими структурами А-домена вH-конформации (2QCS и 3FHI), так как содержит водородную связь A202(С=O)–G206(N-H),характерную для α-спирали ФСК. Наличие этой связи делает структуру 3PVB среди всегоансамбля H-конформаций наиболее близкой к B-конформации. И действительно, как показалипредварительные исследования, использование такой структуры при изучении перехода Адомена из H- в В-конформацию существенно сокращает время расчета.Для выявления роли электростатического «переключателя» R209–D170–R226 и, вчастности, значения остатка R209 в конформационных переходах А-домена были проведенымоделирования не только β-субдомена белка дикого типа, но также несущего точечные мутацииR209I, R209G, R209E и R209K.
Предпосылкой к такому расчету стала работа Р. Стейнберга,свидетельствующая о возможности замены R209 на ряд остатков при сохранении в той илииной степени способности ПКА Iα к цАМФ-индуцированной активации [34]. Все мутациивводились с использованием стандартных возможностей программы NAMD [87].Исходной системой для постановки МД моделирований в этом разделе диссертации былвзят β-субдомен (дикого типа или с мутационными заменами R209), находящийся в Hконформации.
B-конформация β-субдомена использовалась только для оценки частоты истепени ее реализации в поставленных экспериментах (раздел 2.3.3). В ряде опытовмоделирование проводили в присутствии цАМФ, предварительно поместив его в связывающийсайт исследуемого β-субдомена. Точное положение цАМФ определяли путем выравниванияструктуры 3PVB с цАМФ-содержащим комплексом, полученным в ходе докинга (о методикевыравнивания подробнее в разделе 2.5.1). Непосредственный докинг лигандов в сайт А-доменаструктуры 3PVB не был осуществлен в связи с окончанием срока лицензии программыQuantum 3.3.0.2.3.2.
Моделирование конформационного равновесия β-субдоменаИсследование β-субдомена проводилось методом молекулярной динамики (МД) сиспользованием программы NAMD 2.8 [87]. Белок помещался в прямоугольную ячейку,состоящую из TIP3P молекул воды [88], на границах которой были заданы периодическиеграничные условия. Начальные скорости атомов системы были получены при помощираспределения Максвелла-Больцмана. В качестве шага интегрирования был взят временнойпромежуток, равный 2 фс. Межатомные взаимодействия моделировались на основе параметровсилового поля CHARMM27 [89, 90]. При этом для упрощения вычисления кулоновской энергии39использовался метод Эвальда (particle-mesh Ewald, PME) [91], а потенциал Леннарда-Джонса,описывающий вандерваальсовы взаимодействия, обрезался с применением сглаживающейфункции (switching function), радиус включения сглаживания которой равнялся 10 Å, а радиусобрезания – 12 Å.
Следует отметить, что сглаживающая функция с указанными значениямирадиусов использовалась и в методе Эвальда. В этом случае с ее помощью определялисьграницы учета короткодействующей и дальнодействующей составляющей кулоновской энергии.Все перечисленные выше параметры использовались также для моделирования целогоА-домена, методике исследования которого посвящен раздел 2.4.Энергия подготовленных таким образом систем минимизировалась при помощи 10 000шагов алгоритма сопряженного градиента. После этого системы нагревались в течение 100 псдо температуры близкой к 310 K, а затем моделировались 10 нс в микроканоническом (NVE)ансамбле. NVE ансамбль был предпочтительней в этом случае NVT и NPT ансамблей, так какпроцессы, происходящие в ФСК, оказались очень чувствительными к коррекции скоростейатомов, применяемой при контроле температуры.Для каждой из исследуемых систем было предпринято от 8 до 15 расчетов с суммарнымвременем 80 – 150 нс.
Этого времени в первом приближении было достаточно для полученияпредставления об относительной стабильности конформаций β-субдомена. Результатомвыполненных расчетов стали траектории белка (или лиганд-белкового комплекса) в фазовомпространстве9. Равновесные участки этих траекторий сшивались в один файл для каждойсистемы и исследовались методом кластерного анализа в соответствии с методикой,изложенной в разделе 2.3.3.Согласно существующим данным остаток G169, входящий в состав β2β3-петли, образуетCH-π-взаимодействие с гуанидиновой группой R209 [52], что способствует поддержаниюопределенного изгиба β2β3-петли.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
