Диссертация (1145986), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Для обоих доменов рассматривались как H-, таки В-конформации. По результатам докинга положения цАМФ в связывающих сайтах А- и Bдоменов принципиально не отличались друг от друга, поэтому на рисунке 3.1 представленытолько структуры, полученные для А-домена.А.Б.А – H-конформация; Б – B-конформацияРисунок 3.1 – Докинг цАМФ в цАМФ-связывающий сайт А-доменарегуляторной субъединицы ПКА IαВ обоих доменах, находящихся в В-конформации, цАМФ образовывал пять водородныхсвязей (рисунок 3.1 Б) с аминокислотными остатками ФСК (с амидными группами G199 (G323),A202 (A326) и A210 (A334) и с боковыми цепями E200 (E324) и R209 (R333)), что полностью53согласуется с данными рентгеноструктурного анализа [6, 27]. Однако в ходе докинга цАМФ всвязывающие сайты доменов, находящихся в H-конформации, было показано наличие толькотрех водородных связей (G323, A334, R333) для B-домена и четырех (G199, A210, R209, E200)для А-домена (рисунок 3.1 А).Боковые цепи остатков Е200 и Е324 в большинстве известных структур, представленныхH-конформациями А- или B-доменов R-субъединицы ПКА Iα, связаны с N3A-мотивамисоответствующих доменов.
E200 образует водородную связь с амидной группой L135, а E324 –с амидной группой I253, остатка, являющегося гомологом L135 в В-домене. Однако в даннойконкретной структуре А-домена связь E200 с N3A-мотивом была разрушена, а боковая цепьE200 замыкалась на амидную группу своего же остатка. Наличие такой «внутримолекулярной»водородной связи показано для А- и В-доменов, находящихся в В-конформации в отсутствиелиганда. То есть, среди всех структур А-домена, принадлежащих бассейну H-конформаций иреализующихся в присутствии С-субъединицы, рассматриваемая структура была ближе всего кB-конформации.
Исходя из результатов докинга, положение боковой цепи E200, при которомона образует водородную связь с амидной группой своего же остатка, не препятствуетобразованию водородной связи между E200 и цАМФ. Таким образом, водородная связьE200(COO-)–цАМФ(ОН) или гомологичная ей связь в В-домене могут образовываться как вмомент связывания цАМФ, так и во время перехода домена в В-конформацию, а следовательно,остатки E200 и E324 не играют главных ролей в конформационных переходах цАМФсвязывающих доменов. Подтверждает выдвинутую гипотезу и тот факт, что по даннымрентгеноструктурного анализа [5] Rp-цАМФS, известный обратный агонист [65] цАМФсвязывающих доменов белков EPAC и ПКА, тоже образует водородную связь с E200 в Hконформации А-домена, однако конформационный переход, очевидно, не индуцирует.
Крометого, следует отметить, что в цАМФ-связывающих доменах белков EPAC, на местерассматриваемых остатков глутаминовой кислоты находится глутамин, который не способенсвязывать лиганд.В результате, единственная водородная связь, которая принципиально не моглареализоваться в H-конформации, – связь между цАМФ и амидной группой A202 (A326).Расстояние между атомом азота A202 (A326) и экзоциклическим экваториальным атомомкислорода O6 цАМФ составляло ~5,2 Ǻ для А-домена и ~5,4 Ǻ для B-домена, т. е. дляобразования связи необходимо было смещение амидной группы A202 (A326). Однако подобноесмещение в H-конформации произойти не могло, так как амидная группа рассматриваемогоаланина входила в остов 310-спирали ФСК и в соответствии с типом спирали образовывалаводородную связь с карбонильной группой G199 (G323) (рисунок 3.1 А).Нами также была проведена термодинамическая оценка связывания цАМФ с A- и B-54доменами ПКА Iα, находящимися как в H-, так и в В-конформации.Стандартное изменение свободной энергии связывания цАМФ с А-доменом в Bконформации при температуре 304 K (∆G0, T = 304 K) составило -38,7 кДж/моль(∆H0 = -41,1 кДж/моль, T∆S0 = -2,4 кДж/моль); при этом не учитывалась энергия π-электронноговзаимодействия между ароматическим кольцом лиганда и боковой цепью W260.
Такая оценка вобщих чертах сопоставима с экспериментальной (∆H0 = -62,0 кДж/моль, T∆S0 =-20,4 кДж/моль) [73], если принять во внимание, что в эксперименте энергия π-электронноговзаимодействия учитывалась. Константа диссоциации (Kd) цАМФ из лиганд-белковогокомплекса, соответствующая определенной нами ∆G0, равна 2,3·10-7М.Стандартное изменение свободной энергии связывания цАМФ с B-доменом в Bконформации при температуре 304 K (∆G0, T = 304 K) составило -37,9 кДж/моль(∆H0 = -43,0 кДж/моль, T∆S0 = -5,1 кДж/моль).
Соответствующая константа диссоциациицАМФ из лиганд-белкового комплекса оказалась равной 3,1·10-7М. Энергия π-электронноговзаимодействия между ароматическим кольцом лиганда и боковой цепью Y371 так же, как вслучае А-домена, при получении оценки не учитывалась.Аналогичные оценки для А- и В-доменов в H-конформации оказались равны -24,6 и-24,7 кДж/моль и 5,9·10-5М и 5,7·10-5М соответственно.Важно отметить, что если полученные нами значения констант связывания цАМФ с А иВ-доменами, находящимися в В-конформации, близки к экспериментальным, то для Hконформаций тех же доменов наши оценки более чем на порядок превышают значения,приведенные в литературе (таблица 1.1).
Наши соображения по поводу того, какими должныбыть истинные значения этих и других констант, характеризующих активацию ПКА Iα,приведены в разделе 3.5.4 и приложении Б.3.2. Докинг Sp-цАМФS в цАМФ-связывающий сайт B-домена ПКАSp-цАМФS в связывающем сайте B-домена, находящегося в H-конформации, занималнесколько другое положение, чем цАМФ.
Он так же образовывал две связи с белком – самидной группой G323 и боковой цепью R333 – по характеристикам ничем не отличающиеся отаналогичных связей, образуемых цАМФ. Однако связь между экзоциклическим аксиальныматомом серы и амидной группой A334 была разрушена (расстояние между тяжелыми атомамиравнялось 4,4 Ǻ). Вместо нее реализовывалась связь между амидной группой A334 и атомомкислорода O5`, входящим в шестичленный фосфатный цикл. Результатом образования такойсвязи была существенная деформация шестичленного фосфатного цикла Sp-цАМФS, который вотсутствие внешних факторов имеет тенденцию находиться в выгодной конформации «кресла».Sp-цАМФS-связанный B-домен в B-конформации, напротив, был очень близок по55структуре к аналогичному цАМФ-связанному B-домену, что находится в полном соответствии сэкспериментальными данными [27].
Как и цАМФ, Sp-цАМФS образовывал пять водородныхсвязей с аминокислотными остатками ФСК (с амидными группами G323, A326 и A334 и сбоковыми цепями E324 и R333). И только одна из этих связей – между экзоциклическим атомомсеры S1 и амидной группой A334 – характеризовалась большей длиной (3,6 Ǻ).Оба комплекса Sp-цАМФS с B-доменом в H- и B-конформациях, судя потермодинамическим оценкам, оказались слабее, чем аналогичные комплексы, образованные приучастии цАМФ.Стандартное изменение свободной энергии связывания Sp-цАМФS с B-доменом в Вконформации при температуре 304 K (∆G0, T = 304 K) составило -36,7 кДж/моль(∆H0 = -51,7 кДж/моль, T∆S0 = -15,0 кДж/моль). Соответствующая константа диссоциации SpцАМФS из лиганд-белкового комплекса равнялась 4,9·10-7М.
Энергия π-электронноговзаимодействия, как и в случае цАМФ, не учитывалась.Стандартное изменение свободной энергии связывания Sp-цАМФS с B-доменом в Hконформации при температуре 304 K (∆G0, T = 304 K) составило -18,1 кДж/моль(∆H0 = -12,2 кДж/моль, T∆S0 = 5,9 кДж/моль). Соответствующая константа диссоциации SpцАМФS из лиганд-белкового комплекса равнялась 7,7·10-4М.3.3. Докинг Rp-цАМФS в цАМФ-связывающий сайт B-домена ПКА IααПорезультатамдокингаRp-цАМФSвцАМФ-связывающийсайтB-домена,находящегося в H-конформации, было установлено, что Rp-цАМФS образует с белком те жесвязи, что и цАМФ.
Две из них – с амидными группами G323 и A334 – по характеристикамничем не отличались от таковых, образуемых при участии цАМФ, а третья – с боковой цепьюR333 – характеризовалась большей длиной (3,8 Ǻ).Однако выравнивание структур Rp-цАМФS- и цАМФ-связанных доменов в Hконформации показало различное положение экзоциклических экваториальных атомовкислорода и серы (более подробно в главе 4). Это различие связано с несколько инымразмещением фосфатного кольца Rp-цАМФS и большей длиной ковалентной связи P–S (1,95 Ǻ)по сравнению с P–O (1,50 Ǻ) [105].
В результате расстояние между атомом азота A326 иэкзоциклическим экваториальным атомом серы S1 Rp-цАМФS составило ~4,7 Ǻ, чтосущественно меньше соответствующего расстояния, реализуемого при связывании агонистовцАМФ и Sp-цАМФS (~5,2 – 5,4 Ǻ).Положение экваториального атома серы S1, определенное по результатам докинга RpцАМФS в связывающий сайт B-домена, находящегося в B-конформации, практическиполностью совпало с положением соответствующего экваториального атома кислорода O656цАМФ. Таким образом, Rp-цАМФS образовывал пять водородных связей с теми жеаминокислотными остатками белка, что и цАМФ: с амидными группами G323, A326 и A334 и сбоковыми цепями E324 и R333. Однако две из этих связей (образуемые экзоциклическимэкваториальным атомом серы с одной стороны и амидной группой A326 или боковой цепьюR333 с другой стороны) характеризовались большей длиной (3,6 Ǻ).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
