Диссертация (1145986), страница 16
Текст из файла (страница 16)
И хотя по результатам докинга всеисследуемые белок-лигандные комплексы были охарактеризованы как более слабые, ошибкапрограммы Quantum 3.3.0 была существенно меньше заявленной разработчиками предельнойошибки (15%).Опираясь на полученное доказательство корректности численных оценок, предпринятыхнами в ходе докинга, мы рассмотрели вопрос о роли механизмов индуцированного соответствияи отбора конформаций в процессе активации ПКА Iα.Чтобы процесс активации ПКА Iα шел преимущественно путем индуцированногосоответствия, очевидно, необходимо и достаточно выполнения трех условий. Во-первых,цАМФ-связывающие домены R-субъединицы должны находиться преимущественно в Hконформации. Во-вторых, лиганд должен иметь сродство к обеим конформациям.
В-третьих,константа скорости диссоциации в присутствии лиганда должна быть больше, чем в егоотсутствии.Согласно данным рентгеноструктурного анализа А-домен, входящий в состав RACкомплекса, представлен H-конформацией [4, 28, 29]. Наши данные однозначно демонстрируют,что оба агониста (цАМФ и Sp-цАМФS) связываются как с B-, так и с H-конформациями цАМФ16В работе [76] говорится о R-субъединице как о смешанном ингибиторе С-субъединицы. У комплексаC(W196R):RI(R333K) Km увеличивается в 4 раза (что характерно для конкурентного ингибитора), а Vmaxуменьшается в 1,6 раз (что характерно для неконкурентного ингибитора).
Однако авторы не объясняют причинытакого поведения R-субъединицы, а в других работах оно не описывается. Возможно также, что неконкурентноеингибирование характерно только для двойного мутанта C(W196R):RI(R333K). Поэтому мы рассматриваемингибирование С-субъединицы R-субъединицей как конкурентное.61связывающих доменов. Кроме того, экспериментально показано, что константа скоростидиссоциации RAC комплекса увеличивается более чем на два порядка по сравнению соспонтанной диссоциацией, если процесс идет в присутствии цАМФ или его аналога Sp-цАМФS[42, 65].
Таким образом, предположения о существенной роли пути отбора конформаций приактивации RAC комплекса безосновательны.Rp-цАМФS, как следует из наших данных, также связывается с обеими конформациямицАМФ-связывающих доменов, причем его комплексы с B-конформацией, как и в случае сагонистами, более устойчивые. Более того, в соответствии с экспериментальными даннымиприсутствие Rp-цАМФS понижает константу скорости диссоциации RAC комплекса почти напорядок по сравнению со спонтанной [65]. Эти факты однозначно свидетельствуют в пользутого, что Rp-цАМФS препятствует диссоциации RAC комплекса не по механизму отбораконформаций (отбирая H-конформацию), как предполагалось ранее [5], а непосредственноблокируя переход из H- в В-конформацию.Что касается RABC комплекса, то здесь ситуация не столь однозначна.
Дело в том, что,согласно экспериментальным данным, B-домен ПКА Iα практически не взаимодействует с Ссубъединицей и существует в виде ансамбля конформаций [70]. Среди них, очевидно,присутствует и B-конформация. Исходя из этого факта, первая стадия диссоциации RABCкомплекса, представляющая собой связывание цАМФ с B-доменом, может протекать помеханизму отбора конформаций. Дальнейшие процессы, как видно из относительно небольшогозначения константы Kd2B (см. прил.
Б), мало отличаются от процессов диссоциации RACкомплекса. Поэтому с небольшим допущением можно сказать, что активация RABC комплексатоже идет по пути индуцированного соответствия. Rp-цАМФS в таком случае связывается с Вконформацией B-домена (как и оба агониста), но препятствует переходу А-домена из Н- в Вконформацию. Таким образом, суммарное действие Rp-цАМФS выражается в блокированииактивации ПКА Iα.Однако необходимо отметить, что существует по крайней мере две группы условийэксперимента, при которых диссоциация RABC комплекса все же идет по пути отбораконформаций.
К такому выводу приводит возможность использования в этих случаях в качествеактиватора Rp-цАМФS, который не способен вызывать конформационные переходы цАМФсвязывающих доменов по пути индуцированного соответствия. Первая группа условий связанас подбором концентраций субстрата и цАМФ: субстрат должен быть в избытке [34], аконцентрация цАМФ относительно мала (прим. автора диссертации). При достижении такихусловий RCcAMPB комплекс с большей вероятностью диссоциирует на RcAMPB и свободнуюС-субъединицу, чем связывает вторую молекулу цАМФ. Вторая группа условий включает в себянеобходимость наличия в цАМФ-связывающем сайте А-домена мутаций, препятствующих62связыванию лиганда [34, 64].
Тогда единственная молекула лиганда связывается с B-доменом, адальнейшая диссоциация RC комплекса протекает спонтанно. В обоих названных случаяхактивация ПКА Iα идет по пути отбора конформаций за счет B-домена, что косвенно доказываетзначительную степень заселенности B-конформации В-домена даже в составе RC комплекса.3.6. Промежуточные выводы1) А-домен R-субъединицы ПКА Iα, находящейся в комплексе с С-субъединицей,способен связывать лиганды.2) цАМФ, Sp-цАМФS и Rp-цАМФS связываются, как с H-конформацией, так и с Bконформацией цАМФ-связывающих доменов, причем комплексы всех названных лигандов с Bконформацией характеризуются большей устойчивостью. Этот факт (в совокупности с тем, чтов RC комплексе А-домен находится в H-конформации) говорит в пользу преимущественногопротекания активации ПКА Iα по пути индуцированного соответствия.
Механизм обратногоагонизма Rp-цАМФS при этом должен заключаться в блокировании перехода из H- в Вконформацию.3) Смещение амидной группы A202(А326) по направлению к лиганду, по всейвидимости,являетсясвязывающих доменов.механизмом,запускающимконформационныйпереходцАМФ-634. МЕХАНИЗМ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИГАНДОВ с цАМФ-СВЯЗЫВАЮЩИМСАЙТОМ цАМФ-СВЯЗЫВАЮЩИХ ДОМЕНОВ ПКА IααСогласно литературным данным [3, 4, 45], конформационные изменения цАМФсвязывающих доменов при активации ПКА Iα заключаются в их переходе из H- в Вконформацию. В соответствии с предположениями, высказанными в главе 3, к изменениюконформации цАМФ-связывающего сайта, а посредством этого и всего домена, должноприводить смещение амидной группы A202 для А-домена и А326 для B-домена. СвязываниеRp-цАМФS напротив должно препятствовать смещению искомых амидных групп, блокируятаким образом домены в Н-конформации.
Четвертая глава диссертации посвящена выяснениюдетальных механизмов этих процессов.4.1. Взаимодействие цАМФ с цАМФ-связывающим сайтом А-домена ПКА IααВ ходе моделирования динамики β-субдомена А-домена, цАМФ-связывающий сайткоторого занят цАМФ, был продемонстрирован переход искомого субдомена из H- в В-конформацию. На рисунках 4.1 и 4.2 представлены структуры, типичные для H- (рисунки 4.1 А, 4.2 А)и B- (рисунки 4.1 Б, 4.2 Б) конформаций, и обозначены основные параметры, которые могутслужить показателями, характеризующими конформационный переход домена.Как уже было отмечено в главе 3, амидная группа А202 в Н-конформации входит в остов310-спирали ФСК и в соответствии с типом спирали образует водородную связь с карбонильнойгруппой G199.
Длина данной связи по нашим расчетам составляет 3,4±0,1 Å17) (по даннымрентгеноструктурного анализа – 3 Å [4]), при этом расстояние между атомом амидного азотаA202 и экзоциклическим экваториальным атомом кислорода O6 цАМФ по результатам докинга(раздел 3.1.1) составляет ~5,2 Ǻ (рисунки 4.1 А, 4.2 А). Переход в В-конформацию инициируется процессом образования водородной связи с участием этих двух атомов. В результатеостаток A202 смещается, связь A202(N-H)–G199(O) разрушается (4,5±0,1 Å), и спираль ФСКпереходит из 310- в α-форму. Достигнутое положение спирали ФСК закрепляется образованиемводородной связи A202(O)–T207(N-H) (3,6±0,1 Å) (рисунки 4.1 Б, 4.2 Б).17)Статистически обработанные данные, приведенные в главе 4, подробно объяснены в главе 5.64А.Б.А – H-конформация; Б – B-конформация. Обозначены расстояния A202(N-H)–G199(O), A202(O)–T207(N-H) иA202(N-H)–цАМФ(O6) обсуждаемые в тексте.
β2β3-петля и стабильные участки β-субдомена на рисунке неприведеныРисунок 4.1 – ФСК А-домена R-субъединицы ПКА IαПереход β-субдомена в В-конформацию также сопровождается разрывом двухводородных связей между ФСК и β2β3-петлей: G169(N-H)–G206(O) и G169(N-H)–T207(O)(рисунок 4.2). В Н-конформации длины этих связей равны 3,9±0,14 Å и 3,5±0,1 Å, а в Bконформации расстояния между соответствующими атомами увеличиваются до 6,9±0,14 Å и4,9±0,1 Å. Таким образом, в В-конформации расстояние между ФСК и β2β3-петлей существенно больше, чем в H-конформации.Реорганизация спирали ФСК, очевидно, приводит к изменению положения и другихостатков ФСК, среди которых наиболее важен L203.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
