Диссертация (1145986), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Промежуточные выводы1) Смещение амидной группы A202(А326) является механизмом, запускающимконформационный переход цАМФ-связывающих доменов.2) Механизм, лежащий в основе поведения Rp-цАМФS как обратного агониста ПКА Iα,заключается в препятствии смещению искомой амидной группы, а следовательно, вблокировании перехода доменов из H- в В-конформацию.3) «Упаковывание» аминокислотного остатка L203 в гидрофобный карман, образованныйучастками ФСК и β2β3-петли, является одним из главных результатов смещения амиднойгруппы A202(А326). Это событие, вероятно, служит начальной стадией работы гидрофобного«переключателя» L203–Y229 и запускает процесс передачи конформационных изменений сцАМФ-связывающего сайта на отдаленные от лиганда структуры белка.4) Электростатический «переключатель» R209–D170–R226, по всей видимости, играетвспомогательную роль в конформационном переходе цАМФ-связывающих доменов.735.
АМИНОКИСЛОТНЫЙ ОСТАТОК В ПОЛОЖЕНИИ 209 КАК ФАКТОРСТАБИЛИЗАЦИИ B-КОНФОРМАЦИИ А-ДОМЕНА ПКА IααСогласно литературным данным аргинин в 209-ом положении не только участвует всвязываниилиганда,образуяснимводороднуюсвязь,ноиявляетсячастьюэлектростатического «переключателя» R209–D170–R226, которому отводится ключевая роль впередаче конформационных изменений цАМФ-связывающего сайта на отдаленные от лигандаструктуры белка (подробнее раздел 1.3.2) [5, 32, 65, 105]. Этот механизм считают основойконформационного перехода А-домена а, следовательно, и активации ПКА Iα. Особая важностьаргиина в положении 209 подтверждается его инвариантностью в эволюции, а также тем, чтозамена аргинина на схожий по свойствам лизин практически полностью блокирует переходдомена в В-конформацию и повышает константу активации ПКА Iα более чем на порядок [69,70]. Тем не менее в главе 4 мы уже отмечали, что такая точка зрения не вполне согласуется снашими результатами и встречает серьезное противоречие со стороны экспериментальныхданных.
Среди них, несомненно, особое значение имеет тот факт, что домены с точечнымизаменами R209I и R209T практически не отличаются по свойствам от белков дикого типа, хотяэлектростатический «переключатель» у них разобщен [34]. Нам представляется, что аргинин в209-ом положении действительно важен для активации ПКА Iα, однако по крайней мере ряд еговажных функций не реализуются посредством электростатического «переключателя» R209–D170–R226.
Проверке этой гипотезы и попытке установления истинной роли R209 посвященапятая глава настоящей диссертации.В качестве системы для проведения моделирований в главах 5 и 4 используется βсубдомен А-домена ПКА Iα (дикого типа или с точечными заменами R209). Отказ от учета αсубдомена вызван необходимостью уменьшить время расчетов, что подробно обсуждается вразделе 2.3. Однако моделирование β-субдомена не является общепринятой методикойисследования цАМФ-связывающих доменов, поэтому в главе 5 также анализируетсяпригодность такой модели для изучения конформационной динамики соответствующегоцАМФ-связывающего домена.5.1.
Описание конформаций, принимаемых β-субдоменом А-домена ПКА IααПо результатам моделирования и обработки полученных результатов методомкластерного анализа (раздел 2.3.3) нам удалось выделить шесть различных конформаций,характерных для β-субдомена А-домена ПКА Iα. В настоящей главе показано, что заселенностьэтих конформаций зависит от того, какой остаток находится в положении 209.
Однаковероятно, что их устойчивость определяется и другими, не выявленными пока факторами.Средние значения всех параметров, использованных для характеристики конформаций βсубдомена, (подробнее раздел 2.3.3) приведены в таблице 5.1.74B-конформация (рисунок 5.1 А) была выделена нами среди совокупности кластеров какконформация с минимальным значением RMSDB и большим значением RMSDH. Значениядругих параметров также учитывались и подтверждали, что мы имеем дело именно с Bконформацией, известной по результатам рентгеноструктурного анализа [5, 6, 27]. B`-спиральвыявленнойнамиконформации(названияэлементоввторичнойструктурыцАМФ-связывающего домена приведены в разделе 1.3.1.) находится в α-форме и, как результат,водородная связь G199(O)–A202(N), характерная для 310-спирали, оказывается разорванной.Как мы уже обсуждали в главе 4, разрушение этой связи сопровождается смещением амиднойгруппы A202 и имеет решающее значение для образования водородной связи между A202 илигандом.
Водородная связь A202(O)–T207(N) присутствует в рассматриваемой конформации,так как стабилизирует С-конец B’-спирали в ее α-форме, а водородная связь G199(O)–L203(N),хотя и характерна для α-спирали, отсутствует. Также отсутствуют водородные связи G169(N)–T207(O) и G169(N)–G206(O), которые поддерживают в H-конформации минимальноерасстояние между ФСК и β2β3-петлей. Объяснение отсутствию трех названных связейзаключается в невозможности их реализации при правильном размещении боковой цепи L203 вгидрофобном кармане, описанном в главе 4.
В соответствии с нашими (главы 4 и 6) иэкспериментальными данными [30, 33] помещение L203 в этот карман является элементомгидрофобного «переключателя» и лежит в основе механизма конформационного переходацАМФ-связывающих доменов. Сообразно с важностью этого процесса, L203 в B-конформациивсегда «упакован» в гидрофобный карман. В рамках нашей модели этот факт демонстрируетсябольшой энергией взаимодействия между L203 и аминокислотными остатками (G169, D170, иN171), входящими в состав β2β3-петли.H-конформацию (рисунок 5.1 Б) мы выделили среди совокупности кластеров наосновании набора признаков, отличающих по данным рентгеноструктурного анализа А-домен всоставе RC комплекса [4, 28, 29].
К этим признакам относятся 310-форма B`-спирали,минимальное расстояние между ФСК и β2β3-петлей и отсутствие «упаковки» боковой цепиL203 в гидрофобный карман. Присутствие в выявленной нами конформации таких чертстроенияподтверждаетсязначениямипараметров,приведеннымивтаблице5.1.Неожиданностью для нас оказалось то, что исследуемая конформация хотя и характеризуетсяминимальным среди всех конформаций значением RMSDH и максимальным значением RMSDB,однако существенно отличается по этим параметрам от А-домена в составе RC комплекса.
Этонесоответствие, на наш взгляд, должно отражать важную роль С-субъединицы в оптимизацииH-конформации. Иными словами та, «истинная», H-конформация, которую принимает А-доменв составе RC комплекса, в отсутствие С-субъединицы недостижима. Следует отметить, чтоцАМФ, по-видимому, не играет аналогичной роли в оптимизации B-конформации. Это75утверждение основывается на отсутствии существенных различий между B-конформациями вотсутствие и присутствии лиганда.Остальные выявленные нами конформации мы разделили на две группы. В первуюгруппу вошли конформации B-типа (B1, B2, B3), как похожие на B-конформацию, а во вторую H-типа (H1), как похожие на H-конформацию. Основанием для такого разделения сталоположение боковой цепи A202, находящейся в Н-конформациях справа от метиленовой группыG169, а в В-конформациях слева от нее (подробнее в главе 4).Основные различия между B1- (рисунок 5.1 В) и B-конформациями заключаются внебольшом расстоянии между ФСК и β2β3-петлей и образованием водородной связи G199(O)–L203(N), результатом которой является длинная α-спиральная форма B’-спирали.
В светевышеназванных причин правильное размещение боковой цепи L203 в гидрофобном кармане вэтой конформации невозможно. Тем не менее, вследствие небольшого расстояния между L203и β2β3-петлей, наблюдается некоторая минимизация энергии между ними.B2-конформация (рисунок 5.1 Г) также характеризуется водородной связью G199(O)–L203(N). Однако в этой конформации расстояние между ФСК и β2β3-петлей практически такоеже, как в В-конформации.
В результате ни упаковывание боковой цепи L203 (как в Вконформации), ни минимизация энергии (как в В1-конформации) не достижимы. Боковая цепьL203 в этой конформации располагается таким образом, что участие ее во взаимодействиимежду ФСК и B/C-спиралью (L203–Y229) становится маловероятным, а разрушение этоговзаимодействия в свою очередь маловероятно в функционирующем цАМФ-связывающемдомене.
Основываясь на этом наблюдении, мы предположили, что B2-конформация нереализуется в присутствии α-субдомена.B3-конформация представляет собой среднее состояние между B- и B2-конформациямии, как и B2-конформация, по-видимому, присуща только отдельному β-субдомену.Н1-конформация (рисунок 5.1 Д) может рассматриваться как первый шаг на путиперехода из H- в В-конформацию.
Однако как стабильная конформация она существует толькодля β-субдомена с заменой R209K в отсутствие цАМФ.5.2. Заселенность конформаций β-субдомена А-домена ПКА Iα5.2.1. β-субдомен белка дикого типа в комплексе с цАМФ и не связанный с лигандомПри моделировании β-субдомена белка дикого типа в присутствии цАМФ быливыявлены B-, B2- и H-конформации в соотношении 25%, 74%, и 1% (рисунок 5.2 А). Состояниеβ-субдомена в отсутствие цАМФ (рисунок 5.2 Б) описывалось теми же конформациями, но всоотношении 16%, 79%, и 5%.76ПриведенныерезультатыподтверждаютфактстабилизацииB-конформациивприсутствии цАМФ. Кроме того, они в совокупности с экспериментальными даннымипозволяют высказать предположение о стабилизирующем влиянии α-субдомена на Hконформацию А-домена ПКА Iα.
Действительно, согласно данным ЯМР анализа, полученнымна А-домене (а. о. 91 – 260), заселенности В- и Н-конформаций в отсутствие лиганда равны[31]. Наши результаты, полученные на β-субдомене, указывают на слабое предпочтение к Вконформации (2,9 кДж/моль, исходя из соотношения B- и H-конформаций 16:5). Такимобразом, в А-домене ПКА Iα присутствие α-субдомена делает H-конформацию болееустойчивой. В случае других цАМФ-связывающих доменов влияние α-субдоменов настабильность конформаций требует отдельного изучения.Следуетотметить,чтовобеихрассмотренныхсистемахвВ-конформацииреализовывалась водородная связь между боковыми цепями R209 и D170 (рисунок 5.1 А),которая является элементом электростатического «переключателя». В системах, несущихмутации в положении 209, этой связи не существовало ни в одной из конформаций.77Таблица 5.1 – Сравнение конформаций β-субдомена20ПараметрыBRMSDB, Å0,8±0,1[B1***, B2***, H***,H1***]RMSDH, Å3,1±0,1[B1 , H , H1*]Энергия«упаковывания» L203,ккал/моль-3,2±0,1[B1***, B2***,B3***, H***, H1***]G199(O)–L203(N), ÅG199(O)–A202(N), Å20B1******4,4±0,1[B1***, B2***, B3*,H**, H1**]4,5±0,1******[B1 , B2 , H***,H1***]A202(O)–T207(N), Å3,6±0,1[B2***, H***, H1***]G169(N)–T207(O), Å4,9±0,1[B1***, H***, H1*]G169(N)–G206(O), Å6,9±0,14[B1***, B2**, H***,H1**]1,6±0,1[B***, B2†, B3**,H***]2,2±0,15***[B , B2***,B3***, H*,]Кластеры (Конформации)B2B3H1H1,4±0,10,9±0,22,2±0,11,8±0,2[B***, B1†, B3*,[B1**, B2*, H***,[B***, B1***, B2***,*******[B , B2 , B3 , H ]H***, H1*]H1**]B3***, H1*]1,7±0,13,3±0,13,5±0,32,4±0,3****[B ,B1 , B2***,**********************[B1 , H , H1 ] [B1 , H , H1 ][B , B2 , B3 , H ]B3***, H1*]-2,4±0,15[B***, B2***,B3***, H***, H1***]-0,4±0,1[B , B1 , H***]-0,7±0,3[B***, B1***, H**,H1†]0,0±0,3[B , B1 , B3†]0,2±0,1[B***, B1***, B2***,B3**]3,4±0,16[B***, H*]3,4±0,1[B , H**]3,8±0,3[B*]3,5±0,3[B**]3,9±0,1[B , B1*, B2**]3,8±0,1[B , B3*, H**,H1†]3,6±0,1***[B2 , H***,H1***]3,3±0,1[B***, B2***,B3***, H1**]4,9±0,2[B***, B2***,B3***, H**]3,8±0,1[B , B3 , H***,H1†]4,3±0,1******[B , B1 , H***,H1**]4,3±0,2[B1 , B2 , H***,H1**]3,9±0,2***[H , H1**]*****************4,9±0,1[B1***, H***, H1**]6,3±0,13[B**, B1***, H***,H1*]Различия между кластерами показаны в скобках.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
