Диссертация (1145986), страница 21
Текст из файла (страница 21)
В В1- и B2-конформациях этого дестабилизирующего фактора несуществовало.В случае реализации H1-конформации для β-субдомена белка дикого типа, боковые цепиA202 и R209 находились бы в одной и той же области пространства и стерически мешали другдругу. Однако в системах с заменами R209I, R209E, R209G и R209K (в отсутствие лиганда)остаток в 209-ом положении не препятствует образованию H1-конформации. Причина, покоторой H1-конформация становится стабильной только в случае β-субдомена с заменой R209Kпока остается неизвестной. Вероятно, она лежит в образовании выгодных взаимодействий83между боковыми цепями A202 и K209.5.2.6.
β-субдомен с точечной заменой R209K в комплексе с цАМФНесмотря на фиксацию β2β3-петли, только B2- и H-конформации в соотношении 72%, и28% были обнаружены при моделировании цАМФ-связанного β-субдомена с заменой R209K(рисунок 5.2 Ж). B-конформация присутствовала в этой системе, но в следовых количествах, инам не удалось выделить ее в качестве отдельного кластера.Причины особого влияния K209, образующего связь с цАМФ, на стабильность Bконформации рассмотрены в данном разделе диссертации.Боковая цепь R209 крепко фиксирована в цАМФ-связывающем сайте благодарянескольким взаимодействиям.
Эти взаимодействия присутствуют во всех конформациях иподдерживают стабильное во времени положение R209. Два из них представлены водороднымисвязями между боковой цепью R209 и карбонильной группой N171 (рисунок 5.1 А), а третье –CH-π взаимодействием, рассмотренным впредыдущихразделах.В соответствии срезультатами, изложенными в разделе 5.2.5, K209 не может компенсировать отсутствие CH-πвзаимодействия за счет электростатических и вандерваальсовых взаимодействий, как этопроисходит у β-субдомена с заменой R209I.
Более того, боковая цепь лизина короче, чем уаргинина, и стабильных водородных связей между ней и карбонильной группой N171 необразуется. Вследствие названных причин, боковая цепь лизина в 209-ом положенииотличается большой подвижностью в цАМФ-связывающем сайте. Она может формироватьнестабильные водородные связи с карбонильными группами N171 или G169, не образовыватьводородных связей ни с одним из аминокислотных остатков или же (в отсутствие отрицательнозаряженных ионов в цАМФ-связывающем сайте) взаимодействовать с отрицательнозаряженными боковыми цепями аминокислотных остатков β2β3-петли. Последняя изперечисленных ситуаций описана в разделе 5.2.5 и вряд ли имеет большое биологическоезначение: согласно данным рентгеноструктурного анализа цАМФ-связывающий сайт всегдазанят [4], если не лигандом, то низкомолекулярными отрицательно заряженными ионами.В том случае если боковая цепь лизина остается связанной с лигандом, то еенестабильное состояние приводит к одному из следующих последствий.Первое последствие состоит в том, что подвижная боковая цепь K209 постоянно создаетстерические препятствия для боковой цепи A202, затрудняя таким образом как стабилизациюB-конформации, так и переход в нее.Второе последствие заключается в неспособности К209 обеспечить правильную идостаточную фиксацию лиганда в цАМФ-связывающем сайте.
В результате водородные связимежду лигандом и аминокислотными остатками G199 и A210 разрываются, и лиганд уходит с84поверхности белка. Такой исход мы многократно наблюдали в ходе моделирования. Такжеследствием неправильной фиксации лиганда является электростатическое блокированиеперехода цАМФ-связывающего домена в В-конформацию. В случае домена белка дикого типасиловые линии электростатического поля, созданного атомами, несущими основной заряд вцАМФ-связывающем сайте, направлены таким образом, что, двигаясь по ним, атом водородаамидной группы A202 приближается к атому O6 цАМФ и может участвовать в образованииводородной связи с ним (рисунок 5.3 А).
Если цАМФ смещен со своего положения, как можетпроисходить в случае замены R209K, то конфигурация электростатического поля изменяется ивзаимодействие амидной группы A202 с карбонильной группой G169 усиливается, аобразование связи между A202 и лигандом становится маловероятным (рисунок 5.3 Б). Этотвариант развития событий также реализовывался достаточно часто.Для подтверждения гипотезы о влиянии повышенной подвижности боковой цепи K209на стабильность B-конформации мы зафиксировали ее в области пространства, занимаемойR209. При таком положении K209 все возможные препятствия для движения и размещениябоковой цепи A202, в том числе и электростатические (рисунок 5.3 В), были устранены.Результатом моделирования β-субдомена с фиксированными β2β3-петлей и боковой цепьюK209 стали три стабильные конформации – B, B3 и B2 в соотношении 13%, 40%, и 47%(рисунок 5.2 З).Таким образом, причины, по которым замена R209K влечет за собой дестабилизацию Bконформации, заключаются в повышенной подвижности боковой цепи K209 и неспособностиее фиксировать β2β3-петлю.
Оба этих нарушения могут на какое-то время спонтанно исчезать,и тогда В-конформация возникает самопроизвольно. Однако вероятность этого процессачрезвычайно мала, что находит подтверждения в экспериментальных данных [69, 70, 107].85А – β-субдомен белка дикого типа в присутствии цАМФ. Б – β-субдомен белка дикого типа в отсутствие цАМФ.В – R209I в присутствии цАМФ. Г – R209E. Д – R209G. Е – R209K. Ж – R209K в присутствии цАМФ; стрелкойпоказан след B-конформации.
З – R209K в присутствии цАМФ и с фиксированным положением боковой цепиK209. Цветовые обозначения кластеров: B – красный, H – синий, B1 – малиновый, B2 – зеленый, B3 – желтый, H1– голубой. Положение β2β3-петли во всех расчетах зафиксированоРисунок 5.2 – Проекции кластеров конформаций β-субдомена А-домена на плоскость,образованную двумя PC86a)б)в)87Направление силовых линий от положительного заряда к отрицательному показано изменением цвета от синего(«+») к красному («-»). Положительно заряженный атом водорода амидной группы A202, находящийся вэлектростатическом поле, отмечен желтой сферой. Для изображения цАМФ, G199 и остатка в 209-ом положениииспользованы сферы с вандерваальсовым радиусом, а остальные атомы β-субдомена представлены в видефиолетовой ленты.
а) β-субдомен белка дикого типа б) β-субдомен с точечной заменой R209K. цАМФ смещен сположения, занимаемого в домене белка дикого типа в) β-субдомен с точечной заменой R209K. K209 фиксирован вположении, близком к положению R209 в домене белка дикого типа. Картины силовых линий рассчитаны спомощью программы APBS [108]Рисунок 5.3 – Силовые линии электростатического поля, создаваемого атомами O6 и O7 цАМФ,атомом O остатка G199 и аминокислотным остатком, находящимся в положении 2095.3.
Обсуждение результатов5.3.1. Вопрос применимости данных, полученных на β-субдомене к целому цАМФсвязывающему доменуКак уже обсуждалось в главе 2, исследование цАМФ-связывающего домена, имеющего всвоем составе α-субдомен, на предмет заселенности отдельных конформаций – очень затратныйпо времени и трудно реализуемый на практике процесс. Поэтому важно четко определить,насколько данные, полученные на β-субдомене, могут быть перенесены на целый цАМФсвязывающий домен. Действительно исходя из наших данных, далеко не все конформации,выявленные для β-субдомена, достижимы при наличии α-субдомена (например, B2- и B3конформации).
Однако особое значение имеет вопрос о влиянии α-субдомена на заселенностьконкретно H- и B-конформаций, так как именно эти конформации играют четко обозначенныебиологические роли в активации ПКА и функционировании других цАМФ-зависимых белков.Экспериментально показано, что цАМФ-связывающие домены (данные полученыметодом ЯМР на цАМФ-связывающем домене белка EPAC1 [30] и А-домене ПКА Iα [31])находятся в состоянии динамического равновесия между H- и B-конформациями, причем, судяпо заселенностям этих конформаций, их свободные энергии примерно равны (GB~GH).
В случаецАМФ-связывающего домена белка EPAC1 (а. о. 169 – 318) Н-конформация несколько выгоднейB-конформации (доля B-конформации >20%). У А-домена ПКА Iα (а. о. 91 – 244) искомыеконформации по данным ЯМР характеризуются одинаковой устойчивостью [31], хотя вкристаллах присутствует только B-конформация [5]. А у А-домена (а. о. 119 – 244), лишенноголинкерного фрагмента (а. о. 91 – 118), равновесие сдвинуто в сторону H-конформации, чтосвязывают со стабилизирующим влиянием линкерного фрагмента на B-конформацию [31].Исходя из наших данных, β-субдомен А-домена ПКА Iα, так же как и целый домен,находится в состоянии динамического равновесия между H- и B-конформациями, причемсоотношение B- и H-конформаций равно 16:5, то есть B-конформация выгодней H-конформации88примерно на 2,9 кДж/моль.
В соответствии с тем, что для А-домена (а. о. 91 – 244) показаноGB~GH, близость свободных энергий H- и B-конформаций β-субдомена говорит об умеренномвлиянии α-субдомена на их заселенность. Тем не менее это влияние присутствует, и в случае Адомена ПКА Iα проявляется, очевидно, в том, что α-субдомен смещает равновесие в сторону Hконформации. Впрочем, в случае других цАМФ-связывающих доменов α-субдомен, видимо,может смещать равновесие и в сторону B-конформации или не влиять на него. Так, методоммалоуглового рассеяния для RC комплекса ПКА Iα показано, что B-домен в отсутствие лиганданаходится преимущественно в В-конформации, и только мутации β-субдомена могут сделать Hконформацию предпочтительной [70].Таким образом, многочисленные экспериментальные данные дают основание полагать,что на равновесие между H- и В-конформациями могут оказывать влияние α-субдомен и Nконцевые фрагменты цАМФ-связывающего белка.
Однако это влияние умеренно по величине, ив этом аспекте β-субдомен может быть взят за хорошую удобную модель цАМФ-связывающегодомена.Существует еще одно требование, которому должно удовлетворять поведение βсубдомена как модели цАМФ-связывающего домена. Мутации β-субдомена должны оказыватьравное по направленности и степени воздействие как на отдельный β-субдомен, так и насоответствующий цАМФ-связывающий домен. На ряде примеров видно, что это требованиевыполняется. Так методом рентгеноструктурного анализа удалось установить, что внедрениемутации R333K (гомологичной мутации R209K в А-домене) в B-домен ПКА Iα приводит кпреобладанию H-конформации23 [4].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
