Диссертация (1145986), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Всего в переходе А-домена из H- в Вконформацию было выделено семь событий. В этом разделе мы будем использовать буквенные100обозначения этих событий, введенные в приложении В (и в пояснениях к рисунку 6.1), а впоследующих разделах расшифруем, какие конкретные конформационные изменения стоят закаждым из них.Для понимания механизма конформационного перехода А-домена основополагающимявляется ответ на вопрос: следуют ли выделенные события друг за другом в определенномпорядке или же наступают хаотично. Как свидетельствуют наши данные, некоторый порядоксуществует, однако он не является строго детерминированным и носит в ряде аспектоввероятностный характер.Основываясь на видимых закономерностях в очередности наступления событий, мысмогливыделитьстадии,присущиевсемрассмотреннымпереходам.Этистадиихарактеризуются хотя бы одним общим для всех опытов событием и определенным порядкомследования.
Помимо них были обнаружены другие стадии, свойственные лишь части опытов иотличающиеся не столь постоянным составом событий. Сгруппировав все схожие стадии длявсех опытов и не нарушив при этом установленный порядок их наступления, мы составилиудобную для анализа схему показанных нами путей конформационного перехода А-домена(рисунок 6.1). Изучение этой схемы позволило дать общую характеристику исследуемогопроцесса с учетом его одновременной детерминированности и стохастичности.Как следует из приведенных данных (рисунок 6.1), существует несколько чертконформационного перехода А-домена, свидетельствующих о его стохастичности.
Во-первых,события А и Е хотя и занимают с высокой вероятностью определенное место вдетерминированной последовательности событий, но эта вероятность не равна единице. Вовторых, события В и Г характеризуются варьирующей между путями перехода протяженностьюи неравномерностью протекания. И наконец в-третьих, даже те события, которые подчиняютсядетерминированному порядку, могут наступать не только после предыдущего события, но иодновременно с ним (то есть не ранее предыдущего).
В результате в некоторых опытах два иболее события могут происходить на одной стадии, а в других – своя стадия соответствуеткаждому событию.Все перечисленные нами неопределенности конформационного перехода А-доменахорошо укладываются в современное представление о механизме изменения конформациибелка как об ансамбле путей перехода (transition path ensemble) [110, 111]. В зависимости оттипа ландшафта потенциальной энергии возможно два предельных состояния этого ансамбля вфазовом пространстве – локализованное и делокализованное.
В первом случае речь идет огладком энергетическом ландшафте с небольшим количеством барьеров, существеннопревышающих по высоте амплитуду температурного шума (kBT). Все пути перехода на такомландшафте локализованы в узкой области фазового пространства, а сам переход может101описываться такими классическими понятиями как переходные состояния и путь минимальнойэнергии (minimum energy path, MEP, ПМЭ)26. Во втором случае энергетический ландшафтшероховатый, с множеством барьеров, большинство из которых близки по высоте к амплитудетемпературного шума.
В таких системах под влиянием энтропийного фактора ансамбль путейперехода делокализуется в фазовом пространстве, делая понятия переходного состояния и ПМЭнепригодными для описания реальной картины процесса. Локализовать ансамбль путейперехода становится возможным, перейдя от фазового пространства к пространству меньшейразмерности, образованному коллективными переменными, и от ландшафта потенциальнойэнергии к ландшафту свободной энергии. Считается, что при правильном выборе коллективныхпеременных ландшафт свободной энергии будет гладким даже в том случае, если ландшафтпотенциальной энергии был шероховатым. В новом пространстве применительно к пучку путейперехода вводятся уже новые характеристики: вместо переходного состояния – ансамбльпереходных состояний (transition state ensemble), вместо пути минимальной энергии – путьминимальной свободной энергии (minimum free energy path, MFEP, ПМСЭ).
Наряду с ПМСЭиспользуют и более точные оценки пути перехода: путь максимального потока траекторий(maximum flux transition path, MFTP), который, впрочем, сводится к ПМСЭ при T→0 К, и путь,проходящий в центре потока траекторий [111, 112]. Однако расчет последних двух путейсложнее расчета ПМСЭ и пока не имплементирован ни в один из программных пакетов.Таким образом, в рамках настоящей диссертации мы рассмотрели некоторую выборку изансамбля путей перехода, на основании которой получили начальное приближение к ПМСЭ(ПМЭ) (подробнее раздел 6.4).
Вследствие того, что моделирование перехода проводилосьнеоднократно и без приложения внешних сил, полученных приближений должно бытьдостаточно для понимания структурной стороны конформационных изменений А-домена. Нодля описания их энергетической стороны, очевидно, необходимо уточнение ПМСЭ (ПСЭ) ирасчет вдоль него профиля свободной энергии. Учитывая важность хорошего начальногоприближения для таких исследований и имея в планах на будущее их проведение, мырассматриваем изложенные в этой главе результаты не только как самостоятельныйструктурный анализ, но и как необходимый подготовительный этап к дальнейшимэнергетическим расчетам.26Путь минимальной энергии (он же наиболее вероятный путь перехода) можно определить так. Пусть есть путь γв фазовом пространстве, z – произвольная точка на нем, а Pz – гиперплоскость, которая проходит через zперпендикулярно γ.
Тогда γ является путем минимальной энергии, если для любой точки z, принадлежащей γ, z –локальный минимум потенциальной энергии V на Pz [110].102ОпытыСтадия 1Стадия 2Стадия 3Стадия 4Стадии 5–6512345678R209K91011126Стадия 7Стадия 8103Сводная таблица построена на основе данных, приведенных в приложении В. Все стадии даны в том порядке,который установлен кросскорреляционным анализом. Условные обозначения (цвета, штриховка) те же, что вприложении В.
Голубым цветом отмечено событие А, состоящее в восстановлении водородных связей спиралиФСК после устранения деформирующего влияния С-субъединицы. Серым цветом выделен переход ФСК из H- в Вконформацию, включая «упаковывание» боковой цепи L203 в гидрофобный карман (процессы, подробноописанные в главах 4 и 5) (событие Б). Сиреневым цветом показано движение N3A-мотива в сторону от ФСК(событие В), а желтым цветом – поворот B/C-спирали (событие Г).
Образование вандерваальсова взаимодействиямежду Y229 и β-субдоменом отмечено розовым цветом (событие Д). Зеленым цветом показан переход фрагментаB/С-спирали из α- в π-форму и сопутствующее ему увеличение энергии взаимодействия B/С-спирали с ФСК иN3A-мотивом (событие Е). Событие, заключающееся в образовании излома B/C-спирали на месте фрагмента πспирали, а также в фиксации этого излома электростатическим взаимодействием R241–E200 и в меньшей степенивандерваальсовым взаимодействием L238–I204, обозначено темно-бирюзовым цветом (событие И).
Диагональнойштриховкой слева направо снизу вверх отмечены события, совершающиеся в направлении характерном дляперехода из B- в H-конформацию. Кроме того, диагональной штриховкой слева направо сверху вниз отмеченособытие восстановления спирали ФСК после устранения С-субъединицы в опыте 1. Факторный анализ не выявилэто событие, так как оно состоялось сразу после начала моделирования. Однако мы определили его визуально ипоместили в суммарную таблицу для создания более целостной картиныРисунок 6.1 – Схема показанных нами путей перехода А-домена ПКА Iα из Н- в Вконформацию6.3.
Описание событий конформационного перехода А-домена из H- в Bконформацию6.3.1. События, в основе которых лежит конформационное изменение ФСКСобытия А и Б, отмеченные на рисунке 6.1 голубым и серым цветом соответственно,представляют собой конформационные изменения ФСК.Событие А определяется главным образом формированием водородной связи I201(C=O)–Y205(N-H), характерной для α-спирали ФСК. Важно отметить, что это событие не имеетотношения к рассмотренному выше переходу B`-спирали ФСК из 310- в α-форму(разделы 4.1, 5.1), так как названная связь по результатам нашего моделирования присутствуетне только в В-, но и в H-конформации β-субдомена А-домена.
По этой же причине событие Асложно отнести непосредственно к переходу А-домена из H- в В-конформацию. Однакоучитывая непостоянное положение события А в череде других событий, можно предположить,что оно определяет восстановление структуры ФСК после устранения деформирующеговлияния С-субъединицы. Действительно из данных рентгеноструктурного анализа известно, чтобоковая цепь Y205 в RC комплексе образует водородную связь с боковой цепью остатка Ссубъединицы Y247 [4, 28].
Смещение боковой цепи Y205 в сторону С-субъединицы и приводитк разрыву ряда водородных связей, определяющих структуру ФСК. В первую очередь к нимотносится названная выше водородная связь I201(C=O)–Y205(N-H), а в меньшей степени и104соседняя связь E200(C=O)–I204(N-H). Вклад последней связи в событие А менее существенныйи не столь постоянный, потому что процесс ее восстановления сопряжен также с переходом B`спирали ФСК из 310- в α-форму.В отличие от события А, событие Б (рисунок 6.2) не только имеет непосредственноеотношение к переходу А-домена в В-конформацию, но и является пусковым механизмом,приводящим в действие череду остальных событий.
О его совершении можно судить покоррелированному изменению значений девяти параметров. Во-первых, образуются двеводородные связи между цАМФ и белком: A202(N-H)–цАМФ(O6) (подробнее глава 4) иA201(N-H)–цАМФ(O3`). Обе они оказывают сонаправленное положительное воздействие настабилизацию B-конформации. Во-вторых B`-спираль ФСК преобразуется из 310- в α-форму, очем свидетельствуют разрушение связи G199(C=O)–A202(N-H) и формирование связиE200(C=O)–I204(N-H).Одновременнообразуетсясвязь A202(C=O)–T207(N-H),котораястабилизирует B`-спираль в ее α-форме. В-третьих, происходит разрыв водородных связейG169(N)–T207(O) и G169(N)–G206(O), поддерживающих в H-конформации минимальноерасстояние между β2β3-петлей и ФСК.
В-четвертых, боковая цепь L203 укладывается вгидрофобный карман, что сопровождается увеличением энергии взаимодействия между ней иβ2β3-петлей. И наконец, в-пятых, RMSDB(ФСК) уменьшается с 3 Å до 0,6 Å, подтверждая фактперехода ФСК в B-конформацию. Кратко событие Б можно охарактеризовать как образованиесвязи между цАМФ и амидной группой A202, сопровождаемое переходом B`-спирали ФСК в αформу и упаковыванием боковой цепи L203 в гидрофобный карман. Детальному описаниюэтого события посвящены четвертая и пятая главы настоящей диссертации.А.Б.А – H-конформация; Б – B-конформация. Лентами разных цветов показаны надвторичные структуры А-домена:оранжевой – ФСК, фиолетовой – β2β3-петля.
Отмечены аминокислотные остатки, принимающие участие вконформационном переходе (R209, G169, A202, L203) и стабилизирующие B-конформацию (D170). Лиганд всвязывающем сайте не показанРисунок 6.2 – Событие Б. Переход ФСК в В-конформацию1056.3.2. События, в основе которых лежит конформационное изменение N3A-мотиваСобытие В, выделенное на рисунке 6.1 сиреневым цветом, заключается в смещенииN3A-мотива по направлению от ФСК, как показано на рисунке 6.3.На основании рассмотренных переходов можно предположить, что событие Взапускается изменением конформации B`-спирали, а в особенности изменением положения ееостатков L203 и I204, то есть событием Б. В H-конформации боковые цепи L203 и I204 состороны ФСК, а также L135 и F136 со стороны N3A-мотива образуют гидрофобный кластер,при этом расстояние между Сα атомами L135 и I204 равно приблизительно 8Å (рисунок 6.3 А).В результате перехода B`-спирали в α-форму, боковые цепи L203 и I204 удаляются от тогоположения, в котором энергия взаимодействия, стабилизирующего гидрофобный кластер,максимальна.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
