Диссертация (1145986), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Таким образом, даже если Rp-цАМФSразобщает электростатический «переключатель», это не может оказывать существенноговлияния на конформационный переход. По нашим предположениям единственный возможныймеханизм действия Rp-цАМФS заключается в блокировании гидрофобного «переключателя»,который и играет ключевую роль в конформационном переходе. То, каким образом эта рольосуществляется, будет рассмотрено в шестой главе настоящей диссертации.5.4. Промежуточные выводы1) β-субдомен является удобной моделью для изучения конформационной динамикисоответствующегоцАМФ-связывающегодомена.ОднакодоляB-конформацииприиспользовании этой модели может быть несколько завышена или занижена.2) β-субдомен А-домена ПКА Iα находится в состоянии динамического равновесиямежду несколькими конформациями, две из которых (H и B) характерны для любого цАМФсвязывающего домена, независимо от мутаций в β-субдомене и присутствия α-субдомена.3) Для β-субдомена А-домена ПКА Iα B-конформация несколько выгодней, чем Hконформация, что отличает его от целого А-домена и свидетельствует в пользу участия αсубдомена в смещении равновесия в сторону H- конформации.4) Заселенность B-конформации β-субдомена А-домена ПКА Iα увеличивается вприсутствии цАМФ и зависит от ряда аминокислотных остатков, находящихся в некоторыхкритических положениях первичной последовательности белка.
Особое место среди такихостатков занимает R209.965) R209 выполняет свои функции в активации ПКА Iα как посредством участия вэлектростатическом «переключателе» R209–D170–R226, так и не связано с ним.6) Не связанные с электростатическим «переключателем» функции R209 заключаются в:(а) фиксации лиганда в связывающем сайте, (б) поддержании конформации β2β3-петли (в)создании стерически благоприятных условий для размещения A202 в положении, характерномдля B-конформации, и стабилизации этого положения путем образования взаимодействиямежду боковыми цепями A202 и R209.
Выполнение аргинином в 209-ом положении всех трехназванных функций способствует появлению устойчивого энергетического минимума,отвечающего B-конформации, и, вероятно, уменьшению высоты энергетического барьераперехода в него.7) Роль R209 в электростатическом «переключателе» заключается в дополнительнойстабилизацииB-конформацииспомощьюводороднойсвязиR209–D170.Также,электростатический «переключатель» стабилизирует H-конформацию с помощью аналогичнойсвязиR226–D170.Вопрекираспространенномуубеждениюэлектростатический«переключатель» не играет роли в процессе конформационного перехода А-домена.8) Все рассмотренные нами мутационные замены R209 препятствуют выполнению тойили иной функции остатка в 209-ом положении и уменьшают таким образом устойчивость Bконформации (и предположительно повышают энергетический барьер перехода в нее).
Сила ихдестабилизирующего влияния на B-конформацию в присутствии цАМФ увеличивается в рядуI<K<E(G), а в отсутствие цАМФ – в ряду I<E<G<K. Сопоставление этих рядов сэкспериментальными данными по активации ПКА Iα дает основание полагать, что склонность кформированию B-конформации лежит в основе корректного функционирования, как отдельныхцАМФ-связывающих доменов, так и целого белка.9) Ивариантность в эволюции аргинина в 209-ом положении определяется егоспособностью наилучшим образом совмещать выполнение всех перечисленных функций,причем функция, связанная с участием в электростатическом «переключателе», имеет среди нихнаименьшее значение.976.
ХАРАКТЕРИСТИКА МЕХАНИЗМА ПЕРЕХОДА А-ДОМЕНА R-СУБЪЕДИНИЦЫПКА Iαα ИЗ H- В В-КОНФОРМАЦИЮ. РОЛЬ ГИДРОФОБНОГО ИЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКОГО «ПЕРЕКЛЮЧАТЕЛЕЙ» В ИЗМЕНЕНИИКОНФОРМАЦИИ цАМФ-СВЯЗЫВАЮЩИХ ДОМЕНОВВ предыдущих главах детально рассмотрено первое событие перехода А-домена ПКА Iαиз H- в В-конформацию, включающее в себя образовании водородной связи между амиднойгруппой A202 и лигандом и «упаковывание» боковой цепи L203 в гидрофобный карман,образованный β2β3-петлей. Там же показано, что электростатический «переключатель» R209–D170–R226 только стабилизирует конечные H- и B-конформации А-домена, но не принимаетучастие в переходе между ними. Тем не менее в предыдущих главах не дан ответ на вопрос оконкретном механизме, передающем информацию о связывании лиганда на отдаленные от негоструктуры белка. На наш взгляд, эту роль должен играть гидрофобный «переключатель» L203–Y229, подробно описанный в разделе 1.3.2. Впервые такая точка зрения была высказана иэкспериментально подтверждена группой исследователей под руководством Хольгера Рехманна[30, 33].
Однако дальнейших исследований в этом направлении не предпринималось, так какинтересдругихгруппученыхбылобращенвосновномкэлектростатическому«переключателю». Мы решили исправить это упущение и провести моделирование работыгидрофобного«переключателя»сцельюуточненияосновныхпринциповегофункционирования. Также мы предприняли попытку изучить запускаемые гидрофобным«переключателем» события, поскольку сведения о них в литературе отсутствуют.Для проведения расчетов были выбраны А-домены дикого типа и с мутационной заменойR209K, приводящей к разобщению электростатического «переключателя». Обе системымоделировались при фиксированном положении β2β3-петли.
Кроме того, в соответствии сполученными ранее данными (раздел 5.2.6), для успешного моделирования А-домена с заменойR209K была зафиксирована и боковая цепь K209.Итогом предпринятых исследований стало описание механизма перехода А-домена из Hв В-конформацию как частично детерминированной последовательности элементарныхконформационных изменений. А сравнение механизмов переходов двух выбранных системпозволило сделать выводы о функциях электростатического «переключателя» и остатка вположении 209 на уровне целого домена.Изложению и обсуждению полученных в этой серии опытов результатов посвященашестая глава настоящей диссертации.986.1. Оценка результатов моделирования H→B конформационного перехода для Адоменов дикого типа и с мутационной заменой R209KМоделирование конформационного H→B перехода проводилось двенадцать раз для Адомена дикого типа и один раз для А-домена с мутационной заменой R209K в соответствии сметодикой, изложенной в разделе 2.4.2.
В результате было получено тринадцать равновесныхсистем, белковые молекулы в которых визуально схожи между собой и несут черты Вконформации, а также существенно отличаются от исходной структуры, в которой А-домен в Hконформации связан с цАМФ. Для более точной характеристики состояния доменов,достигнутого в результате моделирования, мы выбрали четыре параметра. Эти параметрыпредставляютсобойсреднеквадратичноерасстояниемеждуатомамиА-домена,уравновешенного после совершившегося перехода, и соответствующими атомами того жедомена, закристаллизованного в В-конформации [27]. Первый параметр, RMSDB(ФСК),отражает состояние ФСК; второй, RMSDB(N3A), характеризует положение N3A-мотива; третий,RMSDB(B/C-h), дает сведения о конформации B/C-спирали; четвертый, RMSDB(А), служитмерой различия белковых остовов в целом.
Значения параметров были рассчитаны согласнометодике, изложенной в разделе 2.5.1, и приведены в таблице 6.124.Таблица 6.1 – Среднеквадратичное расстояние между атомами А-домена R-субъединицыПКА Iα в одной из рассматриваемых конформаций и соответствующими атомами того жедомена, закристаллизованного в В-конформацииRMSDB(ФСК),ÅRMSDB(N3A),ÅRMSDB(B/C-h), ÅRMSDB(А), ÅА-домен, находящийся в составе RC комплекса в Н-конформации (данныерентгеноструктурного анализа) [29]А-домен3,257,3515,016,82дикого типаА-домен в конформации, достигнутой в результате моделирования H→B конформационногоперехода (расчетные данные)А-домен0,63±0,01251,93±0,111,68±0,111,20±0,050,621,561,270,98дикого типаА-домен сзаменой R209KВ первой значащей строке таблицы даны значения RMSD, полученные с использованием24Автор благодарен Вершининой Е.
А.за помощь в статистической обработке данных, приведенных в таблице 6.1.25Указана стандартная ошибка среднего, рассчитанная по двенадцати опытам.99только данных рентгеноструктурного анализа [27, 29]. Они показывают различия между H- и Bконформациями А-домена и являются исходными для нашего исследования. В процессемоделирования А-домен должен покинуть H-конформацию, характеризующуюся указаннымизначениями, и прийти в минимум, отвечающий B-конформации, в котором значения всехчетырех параметров близки нулю. Вторая и третья значащие строки таблицы содержатинформацию о том, в какой мере этот процесс состоялся для А-домена дикого типа и смутационной заменой R209K. В обеих системах самые близкие к нулю значения были полученыдля изменения ФСК, а самые далекие от нуля – для N3A-мотива.
Но в целом и те и другиепозволяют утверждать, что в результате предпринятого моделирования для обеих систем быладостигнута B-конформация. А следовательно, разработанная нами методика (раздел 2.4.2)пригодна для изучения H→B конформационного перехода А-домена ПКА Iα.Отдельно стоит отметить достоверно меньшие значения всех параметров, кромеRMSDB(ФСК), для системы с мутационной заменой R209K, чем для домена дикого типа.Возможно, что столь неожиданный результат закономерен, и причины его заключаются ввыполненной нами фиксации выгодного положения боковой цепи 209-ого остатка. Однако мыне беремся делать такие выводы и рассматриваем более близкое к B-конформации состояние Адомена с заменой R209K как ошибку, связанную с отсутствием выборки.6.2.
Общая характеристика стадий и событий перехода А-домена из H- в BконформациюАнализ переходов А-домена из H- в В-конформацию проводился с использованиемфакторного и кросскорреляционного анализов согласно приведенной в разделе 2.4.3 методике.Итогом применения этих методов стало выявление для каждого из переходов факторов ирасположение этих факторов в порядке следования во времени соответствующих им стадий.Полученные таким образом описания всех тринадцати моделирований приведены вприложении В.Исходя из основ факторного анализа, каждый фактор указывает на все изменения,происходящие в белке одновременно.
При этом, судя по нашим результатам, среди них естьтакие, которые практически во всех опытах следуют вместе. Их совокупность мы назвалисобытием. Событием, например, оказался переход спирали ФСК из H- в В-конформацию,включая «упаковывание» боковой цепи L203 в гидрофобный карман. Однако одна стадия можетохватывать и такие изменения конформации, которые не всегда коррелируют друг с другом. Иходновременную в ряде опытов реализацию следует интерпретировать как присутствиенескольких событий в пределах одной стадии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
