Диссертация (1145986), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Этот факт находится в соответствии с нашимирезультатами, демонстрирующими, что замена аргинина в 209 положении на лизин делает Bконформацию практически недостижимой. Изолейцин в 209-ом положении напротив оченьмало влияет на функционирование ПКА Iα [34], и наши данные свидетельствуют в пользу того,что заселенность B- и H-конформаций у этого мутанта практически такая же, как у доменабелка дикого типа.Таким образом, при рассмотрении заселенностей Н- и В-конформаций цАМФ23Этот факт на первый взгляд противоречит нашим результатам, так как нами было показано, что в отсутствиецАМФ мутация R209K мало влияет на протекание конформационного перехода.
Иными словами, в составе RCкомплекса В-домен с мутацией R333K тоже должен находиться в В-конформации и терять контакты с Ссубъединицей. Однако более внимательное рассмотрение искомой кристаллической структуры показало наличие вцАМФ-связывающем сайте неорганического фосфата, который удерживал боковую цепь K333 в том же положении,что и цАМФ.
Так как заряд K333 положительный, следует ожидать, что цАМФ-связывающий сайт B-доменапрактически всегда будет занят органическими или неорганическими анионами, а значит, переход его в Вконформацию будет затруднен.89связывающих доменов можно в первом приближении пользоваться данными, полученными намодели соответствующего β-субдомена. Однако надо учитывать, что доля B-конформацииможет быть несколько завышена или занижена.5.3.2. Роль аминокислотного остатка в положении 209 в функционировании цАМФсвязывающего А-домена ПКА IαВ ходе моделирования было установлено, что для β-субдомена А-домена ПКА Iαхарактерно состояние равновесия между несколькими конформациями. Переход между этимиконформациями есть следствие внутренней подвижности белка и не зависит от присутствиякаких бы то ни было лигандов.
Однако заселенность различных конформаций, зависит как отналичия лиганда в цАМФ-связывающем сайте, так и от аминокислотных остатков, находящихсяв некоторых критических положениях первичной последовательности белка. У β-субдоменов,несущих мутации, но близких по свойствам к белкам дикого типа, заселенность B-конформацииоказывается наибольшей, а H-конформация, напротив, практически не заселена. В то же времямутации, выражающиеся в нарушении процесса активации ПКА Iα, приводят к существенномууменьшению заселенности B-конформации. Наличие агониста (цАМФ) в связывающем сайтесмещает равновесие в сторону B-конформации, а действие С-субъединицы предположительнодолжно быть противоположно направленным и заключаться в стабилизации H-конформации.Важный остаток, влияющий на частоты конформаций, занимает положение 209, и будетподробно обсуждаться ниже. Однако вероятно, он лишь один из многих критических остатков.Так, например, известно, что B-домен ПКА Iα в составе холофермента находитсяпредпочтительно в В-конформации [70], а B-домен ПКА II (PDB ID: 2QVS – ПКА IIα [109],3TNP и 3TNQ – ПКА IIβ [71]) – в H-конформации.
Одно из бросающихся в глаза различиймежду этими доменами – разные аминокислотные остатки в положении гомологичномположению G169 А-домена ПКА Iα. У B-домена ПКА Iα в этом положении находится глицин, ау B-доменов ПКА II – аланин. Как уже обсуждалось выше (раздел 4.4) любые замены глицина вэтом положении на другой остаток приводят предположительно к росту энергетическогобарьера перехода между H- и B-конформациями.
А учитывая тот факт, что заселенности этихконформаций у B-доменов ПКА Iα и ПКА II различны, можно предположить, что заменаглицина на аланин кроме того дестабилизирует B-конформацию.Аргинин в 209-ом положении занимает особое место среди всех критических остатков,таккакявляетсячастьюэлектростатического«переключателя»R209–D170–R226,определяющего, в соответствии с литературным данными [5, 32, 65, 105], функционированиеПКА Iα (раздел 1.3.2). Модель, в которой ключевая роль в активации ПКА Iα отводитсяэлектростатическому «переключателю», базируется в том числе и на инвариантности R209 в90эволюции.
Однако она совершенно не согласуется с экспериментальным фактом, согласнокоторому мутанты R209I и R209T практически не отличаются по своим свойствам от белковдикого типа, хотя электростатический «переключатель» у них разобщен [34]. Также эта модельне объясняет существование цАМФ-связывающих доменов (EPAC, HCN, CNG и т. д.), вовселишенных электростатического «переключателя».
Можно предположить, что далеко не всефункции остатка в 209-ом положении реализуются посредством связей с D170 и R226, инаиболее важные из этих функций требуют его участия в других взаимодействиях. Исходя изэтого, мы решили условно разделить функции остатка в 209-ом положении на связанные и несвязанные с электростатическим «переключателем». Последние обсуждаются в этом разделе, апервые – в разделе 5.3.3, где также изложены наши представления о роли электростатического«переключателя» в активации ПКА Iα.Согласно нашим данным, полученным на серии мутантных β-субдоменов, остаток в 209ом положении действительно имеет важное значение для функционирования ПКА Iα. Наширезультаты позволяют утверждать, что его роль в обеспечении работы белка (без учетаэлектростатического «переключателя») сводится к трём важным составляющим: (а) фиксациилиганда в связывающем сайте, (б) поддержанию конформации β2β3-петли (в) созданиюстерически благоприятных условий для размещения A202 (а возможно, и других остатков ФСК)в положении, характерном для B-конформации, и стабилизации этого положения путемобразования взаимодействия между боковыми цепями A202 и R209.
Выполнение остатком в209-ом положении всех трех названных функций способствует как появлению устойчивогоэнергетического минимума, отвечающего B-конформации, так и уменьшению высотыэнергетического барьера перехода в него.К сожалению, на основании полученных нами данных можно строго говорить только ороли остатка в 209-ом положении в стабилизации/дестабилизации конформаций, принимаемыхА-доменом. Однако наблюдения за поведением систем в ходе моделирования позволяюткоснуться и влияния 209-ого остатка непосредственно на процесс конформационного перехода.Разумеется, все высказанные по этому поводу соображения приводятся только в рамкахобсуждения с целью постановки задач для будущих исследований.
Никакие строгие научныевыводы из этих наблюдений следовать не могут.В соответствии с литературными и нашими данными цАМФ стабилизирует Bконформацию в большей степени, чем H, то есть смещает равновесие в сторону B-конформации[31]. Кроме того, цАМФ вызывает увеличение константы скорости диссоциации R- и Ссубъединиц примерно на два порядка [42, 65], а следовательно, уменьшает высотуэнергетического барьера конформационного (H → B) перехода А-домена.
В то же время, какнам удалось пронаблюдать на примере мутанта R209K (раздел 5.2.6), даже незначительное91смещение цАМФ со своего положения в связывающем сайте может полностью блокироватьконформационный переход А-домена. Это происходит вследствие создания неблагоприятногодля движения амидной группы A202 электростатического поля. Таким образом, правильная икрепкаяфиксациялигандавцАМФ-связывающемсайте–важныйфактордляфункционирования ПКА.
Очевидно, что среди всех рассмотренных нами аминокислотныхостатков только аргинин и лизин при связывании лиганда формируют электростатическое, азначит отличающееся большой энергией, взаимодействие. При этом боковая цепь аргининаобразует водородные связи с карбонильной группой N171 (рисунок 5.1 А) и таким образомфиксирует не только свое положение в цАМФ-связывающем сайте, но и положение лиганда.Боковая цепь лизина короче боковой цепи аргинина и потому не образует постоянныхводородных связей ни с одним из аминокислотных остатков, а наоборот, очень подвижна.Результатом этой подвижности является либо неправильное положение лиганда в связывающемсайте (о последствиях которого говорилось выше), либо разрушение взаимодействий междусайтом и лигандом (водородные связи с G199 и A210) и быстрый уход последнего споверхности белка.
Стоит отметить, что изолейцин образует с лигандом только относительнослабое вандерваальсово взаимодействие и потому уступает по энергии связывания аргинину илизину. Однако он не дестабилизирует другие связи, удерживающие лиганд, и не вызываетизменения его положения в пределах цАМФ-связывающего сайта. В результате изолейцин неуступает лизину в фиксации лиганда, а даже превосходит его.β2β3-петля конформационно подвижный элемент вторичной структуры цАМФсвязывающего домена. В отсутствие стабилизирующих факторов она существует в виде рядаконформаций, однако только в одной из них одновременно реализуется гидрофобный кармандля «упаковывания» боковой цепи L203 и создаются благоприятные условия для того, чтобыA202 мог преодолеть барьер над G169 и занять положение, свойственное B-конформации.Согласно литературным данным, аргинин в 209-ом положении поддерживает правильный изгибβ2β3-петли, а она, в свою очередь, фиксирует положение боковой цепи аргинина.Взаимоподдерживающее расположение этих двух элементов цАМФ-связывающего сайта,необходимое для стабилизации В-конформации и понижении барьера конформационногоперехода, становится возможным благодаря CH-π взаимодействию между гуанидиновойгруппой аргинина и Hα атомом G169, входящего в состав β2β3-петли [52].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
