Диссертация (1145986), страница 20
Текст из файла (страница 20)
*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, †0,05<p<0,1***5,0±0,2[B1***, H***, H1*]6,8±0,4[B1 , H , H1*]************3,4±0,2***†[B , B1 , B2†, B3**]5,0±0,2[B , B1 , B2**,B3**]4,3±0,2[B*, B1**, B2**, B3*,H**]******5,3±0,4[B , B2 , B3*, H**]*****3,4±0,1[B , B1 , B2***,B3***]5,3±0,1******[B , B1 , B2***,B3***]3,5±0,1[B***, B2***, B3***,H1**]3,9±0,14[B***, B1**, B2***,B3***, H1**]*****78А – B-конформация; отмечены водородные связи, образованные боковой цепью R209 с одной стороны и боковойцепью D170 и карбонильной группой N171 с другой стороны. Б – H-конформация.
В – B1-конформация Г – B2конформация. Д – H1-конформация. Показаны только β2β3-петля и ФСКРисунок 5.1 – Конформации β-субдомена, выявленные с использованием метода кластерногоанализа795.2.2 β-субдомен с точечной заменой R209I в комплексе с цАМФРезультаты моделирования β-субдомена с точечной заменой R209I продемонстрировали,что изолейцин в 209-ом положении не препятствует реализации B-конформации. Кроме того,боковая цепь I209 образует электростатическое и вандерваальсово взаимодействия с G169, засчет чего поддерживает правильную конформацию β2β3-петли, хотя и уступает в этомаргинину21. В то же время отсутствие α-субдомена приводит к увеличению подвижности всехструктур белка, включая ФСК и β2β3-петлю, и тем самым усложняет анализ полученныхконформаций.
Решение этой проблемы было достигнуто путем фиксации β2β3-петли, согласнос методикой, предложенной для β-субдомена белка дикого типа. В свете полученных данных оспособности изолейцина в 209-ом положении поддерживать правильную конформацию β2β3петли, ее фиксация не представляется недопустимым вмешательством в конформационнуюдинамику белка.Так же как β-субдомен белка дикого типа, β-субдомен с заменой R209I и фиксированнойβ2β3-петлей находится в состоянии равновесия между тремя конформациями – B, B2 и H всоотношении 54%, 43%, и 3% (рисунок 5.2 В).
Первое, что обращает на себя внимание, – этобольшая заселенность B-конформации, существенно превышающая таковую для β-субдоменабелка дикого типа. Мы предполагаем, что причина стабилизирующего влияния I209 на Bконформацию заложена в положении его боковой цепи. Оба остатка (R209 и I209) занимаюттакие области пространства, что создают благоприятные условия для размещения A202 вположении, характерном для B-конформации, и стабилизируют это положение путемобразования взаимодействия с боковой цепью A202. Однако если судить на основаниивизуальных наблюдений, то изолейцин справляется с этой ролью лучше, чем аргинин.В то же время изолейцин в 209-ом положении оказывает на B-конформацию идестабилизирующее влияние.
В первую очередь оно связано с невозможностью реализациисильного электростатического взаимодействия между I209 и лигандом. Очевидно, чтовероятность потери лиганда из сайта в этом случае увеличивается, а его участие в стабилизацииB-конформации становится ограниченным.
Тем не менее связь лиганда с сайтом даже вотсутствие этого взаимодействия остается сильной, и нам не удалось пронаблюдать уход цАМФс поверхности белка. По этой причине влияние данного фактора не нашло отражения в нашихрезультатах.Второйфактор,дестабилизирующийB-конформацию,заключаетсявнедостаточной по сравнению с CH–π взаимодействием фиксации β2β3-петли. Детально он будетрассмотрен в следующих разделах. При моделировании системы с мутационной заменой R209I21Очевидно, что CH–π взаимодействие, поддерживающее правильную конформацию β2β3-петли в домене белкадикого типа, не реализуется, если остаток в 209-ом положении не имеет π-электронной плотности.80нам удалось избежать его влияния, так как β2β3-петля была искусственно зафиксирована.К обсуждению всех факторов, вносящих часто противоположные вклады в стабилизациюB-конформации, мы вернемся в разделе 5.3.2, однако сейчас отметим, что в соответствии сэкспериментальными данными присутствие мутационной замены R209I лишь немногимзатрудняет активацию ПКА Iα [34].5.2.3.
β-субдомен с точечной заменой R209E, не связанный с лигандомβ-субдомен с точечной заменой R209E из-за отрицательного заряда боковой цепиглутаминовойкислоты,очевидно,лишенспособностисвязыватьцАМФ.цАМФ-индуцированный конформационный переход у него практически не реализуется, чтоподтверждается экспериментальными данными [34]. Однако не исключено, что остатокглутаминовой кислоты в 209-ом положении может оказывать противоположное воздействие настабильность B-конформации в отсутствие лиганда.
Изучению этого вопроса посвящентекущий раздел диссертации.Действительно согласно нашим данным, при моделировании β-субдомена с точечнойзаменой R209E реализуется относительно стабильная B-конформация. А боковая цепь E209 засчет электростатического и вандерваальсова взаимодействия с G169 поддерживает правильноеположение β2β3-петли, хотя и уступает в этом изолейцину. Тем не менее как и в опыте с βсубдоменом,несущимзаменуR209I,анализполученныхконформацийоказываетсяневозможным без дополнительной фиксации β2β3-петли. Влияние ее положения настабилизацию B-конформации при использовании такого приема, разумеется, остается безвнимания.Четыре конформации, B, B1 B2 и H (рисунок 5.2 Г)22, в соотношении 39%, 6%, 7% и48%, было обнаружено при моделировании β-субдомена с заменой R209E и фиксированнойβ2β3-петлей.
Боковая цепь E209 в конформациях B и B2 смещена с положения, занимаемомаргинином в β-субдомене белка дикого типа, в результате чего боковая цепь A202 оказываетсялишенной контактов с E209 и G169. Этот факт негативно отражается на стабильности B и B2конформаций и приводит к повышению заселенности H-конформации.В случае реализации конформации B1 для β-субдоменов белка дикого типа или с заменойR209I, боковые цепи остатков в 209-ом и 202-ом положениях были бы расположены в одной и22Представление результатов кластерного анализа дано в пространстве координат PС1 и PC2 (подробнее раздел2.3.3) для всех систем, кроме системы с заменой R209E. Для нее приведена проекция кластеров на плоскость,образованную факторами PC1 и PC3. Дело в том, что PC3 для β-субдомена с заменой R209E и PC2 для остальныхсистем – это один и тот же фактор. Собственные числа, соответствующие факторам PC2 и PC3, для всех системпочти равны, и в случае R209E PC2 и PC3 меняются местами.81той же области пространства и стерически мешали друг другу.
Однако для домена смутационной заменой R209E B1-конформация становится стабильной. В этой системенебольшое расстояние между ФСК и β2β3-петлей, характерное для B1-конформации, позволяетвосстановить контакты между боковыми цепями A202, E209 и G169.5.2.4. β-субдомен с точечной заменой R209G, не связанный с лигандомИзолейцин и глутаминовая кислота в 209-ом положении оказались в некоторой степениспособным поддерживать правильную конформацию β2β3-петли. Однако мы предположили,что недостаточная ее фиксация этими остатками приводит к дестабилизации В-конформации.Чтобы проверить эту гипотезу, а также более подробно изучить влияние положения β2β3-петлина заселенность конформаций β-субдомена, мы предприняли исследование β-субдомена сточечной заменой R209G.
Глицин в 209-ом положении, очевидно, не мог стабилизироватьконформацию β2β3-петли из-за отсутствия боковой цепи.Как и было предположено, в ходе моделирования такой системы стабильная Bконформация не образовывалась. β2β3-петля в отсутствие стабилизирующих факторовоказалась конформационно подвижным элементом вторичной структуры β-субдомена. Онасуществовала в виде ряда конформаций, однако только в одной из них (той, что обнаруживаетсяв кристаллических структурах цАМФ-связывающих доменов) одновременно возникалгидрофобный карман для «упаковывания» боковой цепи L203 и создавались благоприятныеусловия для того, чтобы A202 мог преодолеть барьер над G169 и занять положение,свойственное B-конформации.
Когда правильный изгиб β2β3-петли достигался случайно,конформация очень близкая к B появлялась на короткое время, а затем быстро разрушалась,сопровождаемая изменением положения β2β3-петли.Тем не менее отсутствие в предложенном эксперименте стабильной B-конформациимогло быть не только следствием несохранения изгиба β2β3-петли, но и ответом на разрушениедругих взаимодействий, в которых боковая цепь 209-ого остатка принимает участие. Дляуточнения фактора, дестабилизирующего B-конформацию, мы зафиксировали β2β3-петлю иповторили моделирование. В результате было обнаружено четыре конформации: B, B1 B2, и H(рисунок 5.2 Д) в соотношении 26%, 8%, 22% и 44%.
Появление стабильной B-конформациисвидетельствовало в пользу важной роли положения β2β3-петли в ее реализации иподдержании. В то же время низкая заселенность B- и B2-конформаций, сдвиг равновесия всторону H-конформации и появление B1-конформации, как и в случае β-субдомена с заменойR209E, были следствием потери контактов между боковыми цепями A202, G209 и G169. Вданном случае причиной потери этих контактов являлось не измененное положение боковойцепи остатка в 209-ом положении, а ее отсутствие.825.2.5.
β-субдомен с точечной заменой R209K, не связанный с лигандомЛизин, как и аргинин, является осноJвной аминокислотой и должен связывать кислыелиганды (как-то цАМФ) с большой аффинностью. Однако замена в 209-ом положении аргининана лизин практически полностью блокирует переход домена в В-конформацию, снижает егосродство к лиганду и повышает константу активации ПКА Iα более чем на порядок [69, 70, 107].Чтобы объяснить такое поведение лизина в 209-ом положении мы предприняли двамоделирования домена с заменой R209K: в отсутствие и присутствии цАМФ.
Результатыпервого приведены в этом разделе, а второго – в разделе 5.2.6.По результатам моделирования в отсутствие цАМФ было обнаружено, что лизин в 209ом положении не поддерживает правильную конформацию β2β3-петли, и стабильная Вконформация в этой системе не реализуется.
Более того, боковая цепь K209 уходит споверхности цАМФ-связывающего сайта и образует электростатическое взаимодействие сбоковой цепью одного из кислых аминокислотных остатков, расположенных в β2β3-петле(D167, E168 или D170). Последний факт представляет особый интерес, так как лизин схож поряду физико-химических свойств с аргинином и ожидается, что поведение этих остатков вцАМФ-связывающем сайте тоже должно быть схожим.
Как видно из приведенных результатов,такое ожидание не оправдано.Чтобы уточнить фактор, дестабилизирующий B-конформацию, в системе с заменойR209K, мы, в соответствии с использованной в предыдущих разделах методикой,зафиксировали положение β2β3-петли и повторили моделирование. В результате было полученопять различных конформаций β-субдомена: B, B1 B2, H1 и H с заселенностями 14%, 12%, 24%,22%, и 28% соответственно.
Как и в опыте с β-субдоменом с заменой R209G присутствиестабильной B-конформации свидетельствовало в пользу ее зависимости от положения β2β3петли. А низкая заселенность B-конформации, сдвиг равновесия в сторону H-конформации ипоявление B1-конформации были ответом на нарушение взаимодействия между боковымицепями A202 и K209. Оказалось, что область, занимаемая боковой цепью A202 в Вконформации, частично перекрывается с областью, занимаемой CH2 группой в β-положениибоковой цепи K209.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
