Диссертация (1145986), страница 17
Текст из файла (страница 17)
В результате смещения L203 его боковаяцепь оказывается над β2β3-петлей и приобретает возможность «упаковываться» в гидрофобныйкарман, образованный этой петлей и ФСК (рисунок 4.2 Б). Существование искомого кармана вовсех конформациях домена является следствием изгиба β2β3-петли (рисунок 4.2), которыйподдерживается CH-π-взаимодействием между атомом водорода при Сα-атоме углерода G169 игуанидиновой группой R209 [52].
«Упаковывание» L203 в гидрофобный карман сопровождаетсяувеличениемэнергиивзаимодействиямеждуL203иаминокислотнымиостатками,образующими данный карман, − G169, D170 и N171. До «упаковывания» она составляет0,2±0,1 ккал/моль, а после «упаковывания» − -3,2±0,1 ккал/моль.65А.Б.А – H-конформация; Б – B-конформация. Оранжевым цветом выделена ФСК, лиловым – β2β3-петля.
Показанперенос боковой цепи A202 над метиленовой группой G169, «упаковывание» L203 в гидрофобный карман иобразование ионной связи между боковыми цепями D170 и R209. цАМФ и стабильные участки β-субдомена нарисунке не приведеныРисунок 4.2 – Часть структуры β-субдомена А-домена R-субъединицы ПКА IαВ ходе моделирования β-субдомена нам удалось продемонстрировать образование в Вконформации ионной связи между боковыми цепями D170 и R209 (рисунок 4.2 Б). Очевидно,эта связь стабилизирует B-конформацию, однако активное участие электростатического«переключателя» R209–D170–R226 в конформационном переходе А-домена (подробноеописание «переключателя» приведено в главе 1) проведенные нами расчеты не подтвердили.Детальному рассмотрению вопроса функционирования искомого «переключателя» посвященыпятая и частично шестая главы настоящей диссертации.Важнойхарактеристикойконформационногопереходалюбогобелка,являетсяэнергетический барьер, разделяющий его конечные конформации.
Однако примененные вдиссертации методы не позволяют даже грубо оценить высоту этого барьера. Представляетсявозможным только предположить, с какими структурными особенностями белка может бытьсвязано его существование. В случае β-субдомена наличие барьера, вероятно, определяетсяпереносом боковой цепи А202 над метиленовой группой G169. В H-конформации боковая цепьА202 располагается «справа» от искомой метиленовой группы (рисунок 4.2 А), а в Вконформации занимает место «слева» от нее (рисунок 4.2 Б), благодаря чему и становитсявозможным образование водородной связи между амидной группой A202 и атомом O6 цАМФ.То, что перенос боковой цепи A202 над метиленовой группой G169 сопровождаетсяпреодолениемэнергетическогобарьера,внекоторойстепениподтверждаетсяконсервативностью (почти инвариантностью) остатков A202 и G169 во всех известных цАМФсвязывающих доменах.66Важно отметить, что переход β-субдомена А-домена из H- в В-конформацию был намипродемонстрирован и в отсутствие цАМФ (подробнее об этом в главе 5).
Этот результат требуетобъяснений, так как очевидно, что смещение амидной группы A202 по направлению кэкзоциклическому экваториальному атому кислорода O6 цАМФ предполагает наличие цАМФ всвязывающем сайте. Мы считаем, что в отсутствие цАМФ движущей силой конформационныхизменений домена является переход спирали ФСК в энергетически более выгодную α-форму, асмещение амидной группы A202 сопутствует этому процессу. Взаимодействие с Ссубъединицей препятствует самопроизвольному изменению конформации А-домена, и в такомслучае связывание лиганда становится единственным возможным путем достижения Вконформации.4.2.
Взаимодействие Rp-цAMPS с цAMP-связывающим сайтом B-домена18 ПКА IααВзаимодействие Rp-цАМФS с цАМФ-связывающим сайтом B-домена анализировалосьна основе данных, полученных методом докинга (разделы 3.1.1 и 3.1.3), квантово-химическихрасчетов (раздел 3.1.4), а также показанного в разделе 4.1 смещения амидной группы остаткаA202 (A326 для B-домена).Представить наглядно все полученные результаты позволяет приведенная в данномразделе схема (рисунок 4.3), на которой отмечены экзоциклические экваториальные атомыкислорода цАМФ O6 и серы Rp-цАМФS S1 (на рисунке O и S), а также возможные положенияазота амидной группы A326 (NH, NB и NS) (см.
пояснения к рисунку 4.3). На рисунке атомыкислорода и серы изображены на некотором расстоянии друг от друга, что являетсяиллюстрацией результатов, полученных методом докинга (разделы 3.1.1 и 3.1.3) и указывающих18Механизм ингибирующего действия серузамещенного аналога цAMФ (Rp-цAMФS) на активацию ПКА Iαрассматривался на примере B-домена, в то время как все данные, полученные методом молекулярной динамики иприведенные в настоящей диссертации, представляют собой исследования А-домена. Это несоответствие связано стем, что докинг Rp-цAMФS был проведен только в связывающие сайты B-домена, и повторить его на А-домене непредставляется возможным вследствие окончания срока действия лицензии программы докинга Quantum 3.3.0.Однако есть веские основания полагать, что данные, полученные на одном домене, могут быть без измененийперенесены на другой домен, если речь идет о процессах, происходящих в β2β3-петле и ФСК.
Действительно, всеаминокислотные остатки, выделенные нами как ключевые в А-домене, присутствуют также и в В-домене, аналожение друг на друга третичных структур А- и В-доменов как в Н-, так и в В-конформациях в области βсубдомена дает практически идеальное совпадение координат аналогичных атомов (RMSD < 1Å). Кроме того, невключенное в данную работу моделирование B-домена методом молекулярной динамики подтвердило, чтоконформационные изменения ФСК в обоих доменах протекают одинаково. Таким образом, наши данные,полученные на А-домене, несущем делеции N3A-мотива и B/C-спирали, вполне могут быть использованы дляанализа событий, происходящих в цАМФ-связывающем сайте B-домена.67на различия в положениях цАМФ и Rp-цАМФS в связывающем сайте B-домена в Hконформации.Точками О и S показано положение экваториальных атомов кислорода и серы лигандов, определенное методомдокинга цAMФ и Rp-цАМФS соответственно в связывающий сайт B-домена в H-конформации.
Способностьискомых атомов кислорода и серы образовывать отличающиеся по длине водородные связи с амидной группойбелка, обозначена с помощью окружностей разных радиусов. Точки NH и NB соответствуют положениям атомаазота амидной группы A326 в H- и B-конформациях, а вектор NHNB – направлению движения данного атома припереходе из одной конформации в другую.
Точкой NS отмечено предполагаемое положение атома азота присвязывании B-домена в H-конформации с Rp-цАМФS. Масштаб не соблюденРисунок 4.3 – Схема, объясняющая предложенную в работе модель Rp-цАМФS-зависимогоингибирования конформационного перехода B-домена ПКА IαВ том случае, если в цАМФ-связывающем сайте находится цАМФ, атом азота амиднойгруппы А326 при конформационном переходе смещается из точки NH в точку NB. В Нконформации (точка NH) расстояние между данным атомом азота и экзоциклическимэкваториальным атомом кислорода цАМФ O6 равно 5,4 Ǻ. В B-конформации, когда атом азотанаходится в точке NB, искомое расстояние уменьшается до 3,0 Ǻ. Именно при таком расстояниипо результатам квантово-химических расчетов (раздел 3.1.4) водородная связь между амиднойгруппой A326 и экваториальным атомом кислорода цАМФ характеризуется максимальнойэнергией связывания.Для Rp-цАМФS в Н-конформации расстояние между атомом азота амидной группы А326(находится в точке NH) и экзоциклическим экваториальным атомом серы Rp-цАМФS S1 равно4,7 Ǻ.
В то же время, исходя из результатов квантово-химических расчетов (раздел 3.1.4),68максимальная энергия водородной связи достигается при расстоянии между искомыми атомамиравном 3,9 Ǻ. Для выполнения этого условия атом азота должен сместиться в точку NS, идальнейшее его смещение будет энергетически невыгодным.
Так, если допустить смещениеатома азота из точки NS в точку NB расстояние между атомами серы и азота уменьшится от 3,9до 2,0 Ǻ и станет меньше суммы вандерваальсовых радиусов этих атомов. Ответом насопутствующее возрастание энергии системы станет возвращение атома азота в точку NS.Таким образом, Rp-цАМФS, находясь в цАМФ-связывающем сайте, позволяет произойтилишь незначительному смещению амидной группы A326, недостаточному для перехода Bдомена из H- в B-конформацию, в результате чего B-домен оказывается блокированным в Hконформации.
Очевидно, что при таком механизме действия Rp-цАМФS не только неиндуцирует переход B-домена в В-конформацию, но и уменьшает вероятность егосамопроизвольного протекания, что, на наш взгляд, и является основой для проявления RpцАМФS свойств обратного агониста ПКА Iα.К сожалению, непосредственное моделирование предложенного нами механизмадействия Rp-цАМФS пока остается неосуществленным. Оно, без сомнения, необходимо дляподтверждениясделанныхвыводов.Однакорассмотренныенамирасчетныеиэкспериментальные (раздел 4.3.2) данные с большой долей вероятности позволяют судить впользу предложенной здесь модели.4.3.
Обсуждение результатов4.3.1. Переход А-домена ПКА Iα в В-конформацию запускается смещениемамидной группы A202С использованием методов молекулярного моделирования нам удалось установить, чтоключевым событием, инициируемым цАМФ при связывании c А-доменом ПКА Iα, являетсяобразованиеводороднойсвязимеждуамиднойгруппойA202иэкзоциклическимэкваториальным атомом кислорода O6 цАМФ. Движение амидной группы A202, без которогоневозможно образование этой связи, приводит к переходу короткой 310-спирали ФСК в болеедлинную α-спираль, а в итоге к смещению остатка L203 и «упаковыванию» его боковой цепи вгидрофобный карман, образованный фрагментами ФСК и β2β3-петли. Последнее событие, какпредполагается [30, 33], является начальной стадией работы гидрофобного «переключателя»(см. раздел 1.3.2).
Оно приводит к повороту B-спирали и передает таким образом конформационные изменения в цАМФ-связывающем сайте на отдаленные от лиганда структуры белка.В свете этих данных роль электростатического «переключателя» R209–D170–R226 вконформационном переходе цАМФ-связывающих доменов представляется вспомогательной.69Подробней этот вопрос рассмотрен в главе 5.Ключевая роль смещения амидной группы A202 (A326) в конформационном переходецАМФ-связывающих доменов согласуется с построенной нами моделью, объясняющейпроявление лигандом Rp-цАМФS свойств обратного агониста ПКА Iα.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
